在实现脂肪酸高效酶促脱羧的漫长过程中

《ACS Central Science》：In the Marathon toward Achieving Efficient Enzymatic Decarboxylation of Fatty Acids

脂肪酸酶催化脱羧生成单烯烃的研究进展。通过优化电子传递系统（引入蓝藻铁氧还蛋白）和反应体系（细胞膜碎片CEF与过氧化氢酶联用），UndB酶的周转数提升至3412，较前人研究提高262倍。结构分析揭示酶家族分为两类，分别偏好C12和C16脂肪酸脱羧。与化学方法相比，生物催化具有低温常压条件，但需突破10^3数量级TON和3个数量级浓度限制。ACS Central Science, 2023.

　　

在本期《ACS Central Science》中，Abhishek Sirohiwal、Debasis Das及其同事将脂肪酸的氧化脱羧反应通过酶促方法推进到了一个新的水平，从而获得了1-烯烃。1-烯烃的生产在全球范围内具有重大意义，因为它们可以作为绿色大宗化学品和下一代“即用型”生物燃料。因此，来自植物油、动物脂肪、林业、发酵、藻类等的脂肪酸可以通过脱羧反应转化为可再生的航空燃料。化学方法通常需要高温（180–340°C）、高压（8–40巴）以及金属催化剂，并且可能会产生多种产物混合物，但它们的显著优势在于可以在较高的底物浓度下进行反应（参见参考文献(a)中的表S1）。而生物催化方法则提供了一种替代方案，因为这类反应通常在常温常压下进行，且具有较高的选择性，从而减少了副反应的发生。 研究中使用的酶（见图1）能够将自由Cn脂肪酸转化为相应的Cn-1 1-烯烃，该酶被命名为UndB，来源于一种假单胞菌（Pseudomonas）物种。UndB是一种不含血红素的二铁结合膜蛋白酶，需要分子氧（O2）和电子转移系统来提供所需的电子。这一系统存在多个挑战：(i) 使用膜蛋白酶；(ii) 需要分子氧；(iii) 从NADPH到O2的电子转移过程中会损失大量的还原当量，导致过氧化氢的生成；(iv) 过氧化氢可能抑制酶的活性；(v) 需要高效地供应电子。为了解决最后一个问题，研究发现来自蓝细菌S. elongatus的铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶是提供电子的最有效系统。由于铁氧还蛋白还原酶需要NADPH作为电子来源，本文报道了一种基于葡萄糖脱氢酶和葡萄糖的NADPH再生系统，这种系统在生物催化中广泛应用。为了克服使用膜蛋白酶带来的挑战，研究人员成功使用了细胞膜组分（CEF，通过细胞裂解和离心获得）作为活性催化剂。为了减少H2O2副产物的负面影响，添加了过氧化氢酶将过量的H2O2分解为水和氧气。经过这些改进后，使用月桂酸C12:0（1 mM）作为底物时，UndB的转化次数（TON）达到了3412，优于之前的研究结果。

图1

图1. 脂肪酸酶促脱羧反应的概念比较

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^a(a) UndB催化的反应。(b) CYP152 OleTJE催化的脂肪酸脱羧有两种不同途径：一种与(a)中的概念类似（使用O2），另一种使用H2O2作为氧化剂。(c) 使用脂肪酸光脱羧酶CvFAP进行的光依赖性脱羧反应。Fd = 铁氧还蛋白；CamA和CamB = putidaredoxin/putidaredoxin还原酶系统；FDH = 甲酸脱氢酶。

与之前仅使用UndB的研究相比，本研究的转化次数提高了262倍；与最佳报道中结合了过氧化氢酶的体系相比，转化次数提高了13倍。

根据一系列相关酶的AlphaFold2结构中某些螺旋的方向，作者将这类酶分为两类，并注意到它们对底物的偏好不同。I类酶（如UndB）偏好月桂酸C12:0作为底物，而II类酶则更倾向于脱羧棕榈酸C16:0。有趣的是，这种特异性与酶的某个远端区域（UndB中的残基154–184）有关；通过将这两个残基替换为Paraglaciecola psychrophile同源物中的相应残基，棕榈酸C16:0的转化次数从1152提高到了2952。通过分子动力学模拟证实了该区域对底物特异性的影响，并将其归因于底物结合口袋的体积变化。 目前基于UndB的系统的一个局限性是底物浓度较低（1 mM），比化学方法使用的浓度低3个数量级。与其他酶促方法相比，可溶性血红蛋白依赖性酶（如CYP152家族）具有优势，因为它们既能进行脱羧反应也能进行羟基化反应。例如，CYP152中的OleTJE可以在不同模式下催化脂肪酸脱羧：第一种模式与UndB类似，反应系统包括电子转移系统（putidaredoxin/putidaredoxin还原酶CamAB）和甲酸或磷酸盐脱氢酶用于NADPH再生（见图1(b)，O2模式）。在这种模式下，月桂酸C12:0在10 mM浓度下的转化次数可达3.26 mM（TON约为500），棕榈酸C18:0在5 mM浓度下的转化次数可达2000。从这个角度来看，当前研究的UndB也达到了类似的转化次数范围。 另一方面，OleTJE也可以仅使用H2O2作为氧化剂，从而无需电子传递链和任何还原剂（见图1(b)，H2O2模式）。从实际应用的角度来看，这种方法更受欢迎，因为只需要一种酶；然而，转化次数仍有进一步提升的空间，目前报道的最高转化次数为肉豆蔻酸C14:0在0.2 mM浓度下的194。如果目标是开发即用型生物燃料，还可以考虑将C12–C20脂肪酸转化为饱和烷烃。对于这一目标，黄素依赖性脂肪酸光脱羧酶（FAP）仅需光照，无需外部电子源进行辅因子再生，在13 mM底物浓度下的转化次数可达到9000（见图1(c)）。由于活性位点受到保护，该酶与饱和脂肪酸的副反应较少。为了实现大规模应用，理想的转化次数应在800,000以上，反应不应依赖牺牲性试剂进行辅因子循环以降低成本，并且应能适应高底物浓度。为了使这一系统在工业上可行，还需要在转化次数和底物浓度方面进一步提高3个数量级。 本文为提高UndB催化的脱羧反应的转化次数做出了重要贡献，使其达到10^3的范围，有望开发出一种基于酶的可行方法，将脂肪酸转化为碳氢化合物生物燃料，作为比现有化学技术更环保的替代方案。