利用特定的肽-蛋白相互作用，从血浆中高效分离并富集SH2结构域蛋白物种

《ACS Omega》：Efficient Isolation and Enrichment of SH2 Domain Protein Species from Plasma Exploiting Specific Peptide–Protein Interactions

纤维二氧化硅微球通过磷酸化肽链修饰后能有效捕获含SH2域的蛋白质，在pH4条件下对SH2-SH2、SH2-SH3、SH2-PTP的捕获效率分别达91%、61.3%、62.96%，显著高于非SH2蛋白。实验证实该材料可特异性富集血浆中SH2域蛋白，浓度提升5.1倍，并通过SDS-PAGE和质谱验证其分离纯化效果。

　　纤维二氧化硅微球通过席夫碱反应修饰了磷酸化肽链，最终获得了名为pPeps@SiO?微球的产物。这种微球能够与SH2结构域的特定位点发生有效相互作用，从而表现出对SH2结构域蛋白的良好捕获性能。在pH值为4的条件下，pPeps@SiO?微球对含SH2结构域的蛋白质（如SH2–SH2、SH2–SH3和SH2–PTP）的捕获效率分别达到了91%、61.3%和62.96%，远高于对不含SH2结构域的蛋白质的捕获效率。通过使用0.1 mol/L的咪唑溶液，吸附的SH2蛋白可以被方便地回收，这为从复杂基质中分离SH2结构域蛋白提供了一种新的策略。SDS-PAGE分析结果表明，利用pPeps@SiO?微球可以从人血浆中成功分离SH2–SH3蛋白，并且该分离过程未受到其他高丰度蛋白成分的干扰。经过pPeps@SiO?微球处理后，血浆中SH2结构域蛋白的浓度从12.4 pg/mL显著提升至61.59 pg/mL，充分展示了该微球在分离和富集方面的优越性能。基于蛋白结构域的分离策略不仅为深入研究SH2结构域蛋白的功能提供了基础，也为蛋白质的分离和纯化提供了新的思路。

SH2结构域是研究蛋白质相互作用的重要起点。作为由约100个氨基酸组成的蛋白模块，SH2结构域最初在致癌蛋白v-Src中被发现，随后在数百种人类蛋白中被鉴定。所有已知的SH2结构域都具有保守的折叠结构，其中央部分包含一个反平行的β折叠片，两侧则呈现出类似三明治的α螺旋结构。SH2结构域能够特异性地识别磷酸化酪氨酸（pTyr）及其C端的3–6个氨基酸残基。它是酪氨酸激酶信号转导通路中的关键组成部分，而Src、Abl、Ras和Raf等癌基因的激活，由于酪氨酸激酶活性的增强，往往直接或间接地受到SH2结构域的调控。SH2结构域相关信号通路的异常与多种肿瘤和遗传性疾病密切相关。例如，在慢性髓系白血病患者中，发现上游Abl蛋白的SH2结构域存在自我抑制功能缺失，从而导致激酶活性增强。这种增强的活性会招募Shc和p62等目标分子，间接激活Ras通路。此外，Grb2作为生长因子受体介导信号传导的主要途径，其SH2结构域的目标分子模拟物有望阻断这一信号传导过程。一些遗传性疾病也与SH2结构域的异常有关，如SAP蛋白的SH2结构域发生点突变或缺失会导致X连锁淋巴细胞增生症，而Bruton’s酪氨酸激酶的SH2结构域中的单点突变则与X连锁无丙种球蛋白血症有关。ZAP-70激酶结构域的突变可能引发严重联合免疫缺陷（SCID），而Noonan综合征患者的SHP-2分子N端基因中的SH2结构域发生点突变，以及生长激素不敏感综合征患者中STAT5b仅表达一半的SH2结构域，均显示出SH2结构域在疾病发生中的重要作用。

鉴于SH2结构域在多种蛋白中的广泛存在及其在调控对应信号通路中的关键作用，生物学家和药理学家对研究其配体识别特性和相关目标分子模拟物表现出浓厚兴趣。Cantley等人证明，SH2结构域能够基于特定氨基酸序列选择性地识别含有磷酸化酪氨酸的蛋白质或合成肽链，而对其未磷酸化的对应物则表现出较低的亲和力。Fantl等人发现，含有pTyr-Met/Val-X-Met序列的肽链对磷脂酰肌醇3-激酶具有高亲和力，而将Met残基替换后，亲和力显著下降。此外，含有Tyr-X-X-Leu/Ile序列的约10个氨基酸长度的肽链可以特异性地识别Src家族中的SH2结构域，并且与具有两个SH2结构域的酪氨酸激酶之间形成双齿结合模式。已有多种策略用于通过合成的磷酸化肽链实现SH2结构域蛋白的分离，例如Testini等人利用基于磷酸肽的亲和树脂研究VEGFR2信号通路，而H?fener等人则采用抑制剂亲和纯化（IAP）方法探索SH2结构域相互作用。在此基础上，我们设计了一种新的平台，即将含有磷酸酪氨酸的肽链接枝到纤维状二氧化硅微球上。这种设计利用了微球的高比表面积和良好可及性，从而实现对SH2结构域蛋白的非共价特异性富集，为我们的分离策略奠定了基础。

通常，具有孔结构的材料被称为多孔材料，根据孔径大小可分为大孔（>50 nm）、中孔（2–50 nm）和微孔（<2 nm）。研究表明，穿透性的中孔和大孔结构有助于降低扩散阻力，提供更大的接触面积，并增加活性位点数量。以二氧化硅为基础的多孔材料因其优异的耐酸碱性能、易于通过多种方法合成以及丰富的原料来源而受到广泛关注。特别是纤维状二氧化硅微球，其广泛分布的中孔网络和纤维状结构使其具有层次化多孔结构，因此本研究选择纤维状二氧化硅微球作为载体，用于携带肽链以实现蛋白质的分离和纯化。SH2结构域与磷酸化酪氨酸肽链的结合主要依赖于磷酸化酪氨酸周围的氨基酸序列，而这些氨基酸的排列是实现特异性结合的关键。因此，我们精心设计了具有特定氨基酸排列的磷酸化酪氨酸肽链，并通过席夫碱反应将其共价固定在多孔纤维状二氧化硅微球表面，从而实现对SH2结构域蛋白的特异性捕获。

通过扫描电子显微镜（SEM）观察，纤维状二氧化硅微球呈现出由交织纤维构成的球形结构，平均直径约为500 nm，并且具有典型的中孔结构。在肽链修饰后，微球的中孔特征依然保持良好，这表明其结构在功能化过程中未受到明显破坏。透射电子显微镜（TEM）图像显示，pPeps@SiO?微球的粒径有所增加，而孔径减小，这可能是由于肽链的接枝导致了表面结构的轻微变化。通过能量色散X射线光谱（EDX）映射图像，我们观察到pPeps@SiO?微球表面的碳、氮和磷元素分布均匀，其中磷含量达到23%，这归因于磷酸化酪氨酸肽链在微球表面的局部富集。EDX技术对样品表面最外层1–2 μm范围内的元素敏感，因此所观察到的高磷含量不仅表明肽链成功接枝，也证明其在微球表面的均匀分布。

X射线衍射（XRD）分析进一步确认了纤维状二氧化硅微球及其修饰后的pPeps@SiO?微球的结构完整性。在2θ = 22.13°处观察到的宽扩散峰表明，二氧化硅框架在肽链修饰后仍保持稳定。热重分析（TGA）结果显示，纤维状二氧化硅、氨基化二氧化硅（SiO?–NH?）、GA@SiO?微球和pPeps@SiO?微球均在100 °C附近出现初始重量损失，这归因于物理吸附或晶体水的释放。当温度升至约200 °C时，纤维状二氧化硅微球表面的有机层开始分解，而pPeps@SiO?微球的DTG曲线显示，在约210 °C时出现内热峰，对应于微球表面氨基基团的分解，同时在约461 °C时出现另一个内热峰，这代表了修饰肽链的分解温度。这些结果进一步证明了肽链在微球表面的稳定接枝。

为了验证磷酸化酪氨酸肽链与SH2结构域蛋白的结合能力，我们采用了电喷雾电离质谱（ESI-MS）技术。该技术虽不能直接测定结合强度，但其高灵敏度和温和条件使其成为检测非共价复合物的有效工具。图5展示了SH2结构域蛋白SH2–SH3与不同比例的磷酸化酪氨酸肽链（pPep1）结合后的ESI质谱结果。通过电喷雾电离质谱分析，SH2–SH3蛋白的分子量被确认，其质谱图中出现多个带电离子峰，其中质量/电荷比（m/z）为1164.99的峰对应于带有19个正电荷的离子，其计算分子量为22,114.6 Da，与理论值相符。这表明SH2–SH3蛋白在原生条件下被正确识别且保持完整。当SH2–SH3与pPep1的摩尔比达到1:10时，图5C中无法观察到游离的SH2–SH3信号，表明其已完全与肽链结合形成非共价复合物。相比之下，非磷酸化肽链（pPep2）即使在10倍于SH2–SH3的浓度下，也无法形成类似的复合物，进一步支持了SH2结构域对磷酸化酪氨酸肽链的特异性结合。

为了进一步研究pPeps@SiO?微球对SH2结构域蛋白的捕获行为，我们考察了不同pH条件下SH2–SH2、SH2–SH3、SH2–PTP、PTP、HSA、IgG和Trf等蛋白质的吸附情况。如图6A所示，在pH 4.0条件下，含SH2结构域的蛋白质表现出显著更高的吸附效率。其中，SH2–SH2、SH2–SH3和SH2–PTP的吸附效率分别为91%、61.3%和62.96%，而不含SH2结构域的蛋白质（如PTP、HSA、IgG和Trf）的吸附效率仅为19.67%、19.14%、15.53%和12.18%。这种吸附差异可归因于SH2结构域与肽链之间的多价相互作用。我们推测，SH2结构域中的Arg205（βD1）可能与肽链中的磷酸化酪氨酸残基和靠近磷酸化酪氨酸的第二个Glu残基之间发生静电相互作用。同时，肽链中的Lys200（βD3）和Tyr202（βD5）可能与SH2结构域中的β-4链上的相关残基形成氢键，而肽链中的Ile可能通过范德华力与SH2结构域的疏水口袋结合。这些多种相互作用机制共同促进了SH2结构域蛋白在pPeps@SiO?微球上的高效吸附。

为了进一步探讨不同pH条件对微球表面电荷特性的影响，我们进行了Zeta电位测量（如图6B所示）。在pH 7时，微球表面呈现负电荷，而SH2融合蛋白的理论等电点位于6.5–7.2之间，表明其在pH 7时接近中性或轻微正电荷。这种电荷状态的差异使得正电荷的SH2蛋白能够与负电荷的微球表面发生有利的静电相互作用，从而增强结合特异性。此外，通过圆二色光谱（CD）分析，我们发现SH2–SH3在不同pH条件下表现出以β折叠为主的二级结构（如图7B所示），这与其在SH2结构域中的典型β折叠结合沟槽结构相吻合。相比之下，SH2–SH2和SH2–PTP的CD光谱显示其二级结构更为复杂，而非以α螺旋为主，这可能源于结构域之间的相互作用（如SH2–SH2中的结构域–结构域包装）或相邻功能结构域的干扰（如SH2–PTP中的PTP结构域），导致结合位点的可及性降低，进而影响其与肽链的结合能力。此外，在pH 7时，IgG表现出显著的吸附增强，这可能与其正电荷状态与微球的负电荷状态之间的静电相互作用有关。

为了验证pPeps@SiO?微球在实际应用中的分离能力，我们进一步研究了其在人血浆中对SH2结构域蛋白的捕获效果。为了突出其捕获能力，我们取1 mL人血浆样本，并将其与100 μg/mL的SH2–SH3蛋白混合后进行吸附实验，随后使用0.1 mol/L的咪唑溶液进行回收。通过SDS-PAGE分析（如图8所示），我们发现未经处理的人血浆样本（Lane 2）中存在多个蛋白条带，覆盖分子量范围为6.5–200 kDa，主要由IgG（150 kDa）、转铁蛋白（Trf，80 kDa）、人血清白蛋白（HSA，66.4 kDa）、IgG重链（50.0 kDa）、IgG轻链（25.0 kDa）和SH2–SH3（22.11 kDa）等组成。而在使用pPeps@SiO?微球处理后的上清液（Lane 3）中，高丰度蛋白如HSA、IgG和Trf的条带几乎未发生变化，而SH2–SH3的条带显著变浅，这表明微球成功捕获了目标蛋白。最终回收的溶液（Lane 4）中仅出现一条SH2–SH3蛋白条带，进一步证明了pPeps@SiO?微球在复杂生物样本中对SH2结构域蛋白的高效捕获和回收能力。

为了量化pPeps@SiO?微球在人血浆中对SH2结构域蛋白的捕获效率，我们采用人Csk/Src分子C端激酶（C-src）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒对原始血浆和处理后血浆中的SH2结构域蛋白含量进行检测。结果显示，原始血浆中SH2结构域蛋白的浓度为12.4 pg/mL，而经过微球处理后的回收溶液中该蛋白的浓度提升至61.59 pg/mL，表明共富集了61.59 pg的SH2结构域蛋白，实现了约5.1倍的富集效果。这一结果进一步验证了pPeps@SiO?微球在复杂生物样本中对SH2结构域蛋白的高选择性捕获能力，同时也展示了其在实际应用中的潜力。该微球不仅能够有效分离和纯化含SH2结构域的蛋白质，还为研究SH2结构域蛋白与癌症之间的关系提供了有力工具。