基于等位基因特异性的CRISPR-Cas9比率荧光平台，用于便携式EGFR L858R突变检测

《Analytical Chemistry》：Allele-Specific CRISPR-Cas9-Based Ratiometric Fluorescence Platform for Portable EGFR L858R Mutation Detection

便携式CRISPR-Cas9荧光传感器实现低丰度EGFR L858R突变检测，通过sgRNA工程化激活Cas9切割荧光标记的阻隔DNA，增强Cy5荧光，同时HBC-530荧光因温度稳定性下降而减弱，形成双通道比率读出，3D打印设备可在0.01%突变频率下实现单核苷酸特异性现场快速检测，验证样本中临床诊断100%一致。

　　

从循环肿瘤DNA（ctDNA）中有效检测低丰度的EGFR L858R突变对于早期非小细胞肺癌（NSCLC）的诊断至关重要。本文提出了一种基于CRISPR-Cas9的便携式比率荧光传感器。通常，通过设计sgRNA将L858R突变定位到Cas9的PAM区域，从而实现Cas9的等位基因特异性激活以及Cy5/BHQ2标记的阻断DNA的切割，进而增加Cy5的荧光强度。同时，由于释放的输入RNA与Pepper适配体结合，导致阻断DNA-RNA杂合物的熔解温度（Tm）降低，HBC-530的荧光强度减弱。因此，可以轻松实现双通道比率荧光检测。最终，利用一种紧凑的3D打印设备实现了对L858R突变的可视化即时检测（POCT），其等位基因检测灵敏度可达0.01%，且具有单核苷酸特异性。对22份血浆样本的验证结果显示，该检测方法与临床诊断结果完全一致。该平台为NSCLC筛查提供了一种成本效益高且易于使用的解决方案，特别适用于资源有限的医疗环境。