丙氨酸对映异构体中17O的单晶核磁共振（Single-Crystal NMR）

《ACS Physical Chemistry Au》：Single-Crystal NMR for 17O in Alanine Enantiomers

单晶固态核磁共振（ssNMR）结合X射线衍射和密度泛函理论（DFT）研究了左旋和右旋丙氨酸中17O核的化学环境与手性关联，揭示了手性分子中电子结构的对称性差异及四极矩耦合常数（CQ）和化学位移各向异性（CSA）的实验与理论一致性。

　　单晶固态核磁共振（ssNMR）光谱技术能够详细分析晶体分子的电子结构，为研究分子手性提供了独特的机会。分子手性是理解生命起源和功能的关键特征，对生物系统和化学反应具有重要影响。本研究通过结合单晶ssNMR光谱、X射线衍射和密度泛函理论（DFT）计算，探讨了在晶体形式的丙氨酸对映异构体中，¹⁷O核的电子结构。我们观察到了单位晶胞中的八个磁性非等效的¹⁷O共振，并成功地进行了归属，同时确定了其对应的NMR张量参数。这些共振由四个对称相关位置中的化学不同的氧原子组成。实验结果与之前NMR研究以及本研究中进行的DFT计算进行了比较。DFT结果不仅支持了晶体学不同¹⁷O位点的归属，还揭示了之前未观察到的化学屏蔽张量的非对称分量。本研究首次全面表征了丙氨酸对映异构体中的¹⁷O NMR张量，突显了将单晶ssNMR与X射线衍射和DFT计算结合以推进对氨基酸分子手性电子结构理解的潜力。

分子手性在生命体系中具有重要作用。通过研究碳质球粒陨石中发现的l-氨基酸相对于d-对映异构体的富集，表明可能在恒星环境中存在非生物机制生成这种对映异构体富集。一些非生物模型已经提出，以解释氨基酸的对映异构体富集。其中，磁手性模型计算出丙氨酸的对映异构体富集高达0.02%，许多α-氨基酸的正对映异构体富集，以及阳离子异亮氨酸和偶极丙氨酸的对映异构体富集高达0.01%。手性影响了在相对论性轻子（如反电子中微子）中的核相互作用速率，可能导致它们转化为¹⁴C。这种机制可能对d-氨基酸的破坏比其l-对映异构体更为有利。在单晶ssNMR实验中，手性分子在高磁场中的取向影响了电子环境，使得化学屏蔽张量的非对称分量发生变化，表现出反射对称性。

本研究最初旨在通过实验验证磁手性模型的预测。主要目标是研究氨基酸样本中¹⁴N核的非对称化学屏蔽（ACS）张量。然而，这一目标尚未实现，因此我们转向研究氨基酸中的氧原子。在三个稳定的氧同位素（¹⁶O、¹⁷O和¹⁸O）中，只有¹⁷O（I = 5/2）是NMR活性的。作为一个四极核，¹⁷O可以作为¹⁴N的替代探针，用于研究大多数氨基酸的手性环境。

尽管溶液中的¹⁷O NMR研究提供了有价值的见解，但溶液研究无法完全捕捉这些系统的详细电子和结构信息，因为分子取向的随机化导致了大量信息的丢失。ACS对化学屏蔽各向异性（CSA）的贡献通常通过溶液态NMR的弛豫研究进行间接推断。然而，固态NMR可以提供关于四极核和化学屏蔽各向异性的信息。对于四极核（I > 1/2），四极和ACS成分是耦合的，也可以通过固态NMR光谱进行测量。为了更全面地理解氨基酸的分子结构，并更好地表征生物重要分子中氧的电子状态，必须使用先进的固态NMR技术，如单晶NMR（SCNMR）。

在本研究中，我们研究了¹⁷O核的四极张量和化学屏蔽各向异性张量在丙氨酸对映异构体中的情况。通过SCNMR光谱技术，确定了这些张量在实验中相对取向。由于自然丰度较低（约0.04%），需要使用同位素富集的样品以实现快速且简便的¹⁷O NMR光谱实验。实验结果与之前报道的丙氨酸对映异构体的NMR研究以及使用已发表晶体结构进行的周期性DFT计算进行了比较。DFT模型使用了PBEsol交换-相关泛函。NMR张量的计算使用了包含投影的GIPAW方法。我们还提供了¹⁴N核的类似计算数据。

在上述方程中，?_Q⁽¹⁾、?_Q⁽²⁾和?_CSA⁽¹⁾分别代表一阶四极相互作用、二阶四极相互作用和一阶化学屏蔽各向异性。术语δ_iso表示各向同性化学屏蔽，而组件R_2,λ^ξ（其中ξ = CSA或Q，λ = 2, 1, 0, ?1或?2）代表在实验室（旋转）框架中定义的张量空间部分。在这里，I是核自旋量子数，I_z是角动量算符的z分量，eQ是核四极矩，γ是磁旋比，ω₀是核拉莫频率。在实验室框架中定义的球形张量R_2,λ^ξ可以通过单步坐标变换，利用极角θ和方位角?，与在测角器-木架框架中定义的G_2,λ^ξ张量相关联。

在实验中，我们通过使用上述表达式对实验获得的?x^T、y^T和?z^T旋转模式进行最小二乘曲线拟合，确定了CSA和四极张量参数G_mn^ξ（其中m和n是x、y或z）。然后通过矩阵对角化获得张量在相应主轴框架（PAFs）中的参数。相应的特征向量矩阵提供了每个张量相对于测角器-木架框架的相对取向。这些主成分代表了独特的分子特性，并为描述相应的NMR张量相互作用提供了通用框架。在主轴框架中，CSA张量可以通过Haeberlen约定表示为以下形式：

δ_iso = (δ₁₁ + δ₂₂ + δ₃₃) / 3

δ_CS = δ₃₃ ? δ_iso

η_CS = (δ₂₂ ? δ₁₁) / δ_CS

其中，|δ₃₃ ? δ_iso| ≥ |δ₁₁ ? δ_iso| ≥ |δ₂₂ ? δ_iso|。四极耦合常数（C_Q）和不对称参数（η_Q）对于电场梯度（EFG）张量可以使用Haeberlen-Spiess约定表示为：

C_Q = (eQ · V₃₃) / h

η_Q = (V₂₂ ? V₁₁) / V₃₃

其中，|V₃₃| ≥ |V₁₁| ≥ |V₂₂|。

CSA和EFG张量可以使用上述NMR参数在相应的主轴框架中定义。张量在主轴框架和测角器-木架框架之间通过单位变换相连。通常，四极相互作用的主轴框架被选为共同参考系，从而在相同的坐标系统中表达CSA张量的主轴框架。当采用晶体框架作为共同参考系时，四极和CSA的主轴框架可以通过以下张量变换，转换为测角器-木架框架，该框架对应于安装晶体的物理取向，使用三步被动旋转涉及欧拉角集合（α₁、β₁、γ₁）：

PAF(CSA) → (a, b, c) PAF(Q) → (ζ, λ, ν) Crystal frame → (α, β, γ) Goniometer frame

因此，每个框架中的张量（例如A和B）通过单位变换相关联。

在实验部分，我们详细描述了¹⁷O标记的制备过程。通过将对应的丙氨酸甲酯盐酸盐（Ala-OMe·HCl）与钠乙氧基（NaOEt）和同位素富集的水（H₂¹⁷O）进行皂化反应，实现了丙氨酸对映异构体的标记。丙氨酸甲酯盐酸盐和钠乙氧基均从Sigma-Aldrich购买，而同位素富集的水（富集约40%）则从剑桥同位素实验室（CIL）购买。相关的化学反应见方案1。合成的细节可以在支持信息中找到。在这个反应中，只有其中一个羰基氧会来自标记的水试剂，因此产物的标记度将是起始原子百分比的一半。

丙氨酸对映异构体中¹⁷O标记的加入程度被测量为与溶液NMR预测的20原子百分比相似。在溶液NMR中，265 ppm的羧酸盐共振强度被参照自然丰度的D₂O溶剂。质谱分析确认了每个标记化合物的同位素掺入情况（见支持信息）。收集的所有¹H和¹³C NMR光谱均与文献一致。

为了进行单晶研究，我们分别制备了d-和l-丙氨酸的单晶。通过将约1.5克产物溶解在约9毫升冷去离子水中，然后在室温下缓慢蒸发，制备了单晶。大约45天后，收集了晶体。晶体被迅速用冷去离子水洗涤以去除表面杂质，并在室温下储存。通过交叉偏振光显微镜技术筛选单晶，以消除孪晶和多晶；本质上，通过旋转样品并观察均匀的光透射来确认样品的纯度。用于研究的单晶尺寸约为4 × 5 × 2 mm³（l-丙氨酸）和3 × 5 × 2 mm³（d-丙氨酸）。晶体被用环氧树脂粘贴到测角器NMR探针的木架上。

单晶X射线衍射分析用于确定晶格结构参数。在密歇根大学的电子微束分析实验室（EMAL）使用粉末X射线衍射（XRD）分析了d-和l-丙氨酸样品的晶格参数。在反射模式的Bragg-Brentano几何下，使用Rigaku Ultima IV X射线衍射仪分析了粉末样品。Cu阳极X射线束（40 kV，44 mA）被20 μm厚的镍箔过滤以去除Cu Kβ，提供单色Cu Kα X射线。散射、接收和发散狭缝分别设置为2/3°、2/3°和0.6 mm。扫描范围从5°到70°，步长为0.02°，扫描速率为1° min^–1。通过将观察到的晶面间距（d_hkl）与适当的米勒指数（hkl）对应，恢复了单位晶胞参数（a、b、c、α、β、γ）。索引过程使用EXPO2014通过N-TREOR09程序进行，N-TREOR软件的演变见相关文献。粉末XRD确认了单位晶胞与报告的晶体结构匹配；我们测量的d-和l-丙氨酸晶体参数见表1。

通过所谓的“Omega-Scan”方法确定了安装的单晶的取向。使用安装晶体的表面法线和边缘平面方向来找到取向矩阵，并最终确定晶体框架相对于木架框架的取向。对于d-丙氨酸晶体，欧拉角为352.7°、90.0°和135.0°，而l-丙氨酸晶体的欧拉角为333.5°、33.7°和90.0°（见支持信息以获取更多细节）。

NMR光谱的采集使用了布鲁克Avance III控制台和Topspin 3.6软件（布鲁克生物公司）在佛罗里达州塔拉哈西的国家高磁场实验室（NHMFL）进行。使用了一种定制的低-E 600 MHz静态HX探针（见图1a、b），该探针由NHMFL开发。测量过程中使用了交叉线圈的6.5 mm ID圆9圈X通道检测线圈，安装在探针内部并与低电感¹H通道环形间隙谐振器正交。低E线圈和相关的探针电路已在文献中详细描述。

该探针针对¹⁷O检测进行了优化，并且使用¹H去耦合进行操作，位于600 MHz（14.1 T）的89 mm直径磁体中。木架上的晶体被安装在测角器的凹槽轨道中，并位于6 mm内径环形间隙谐振器型NMR样品线圈内，以实现定义的旋转模式下的SCNMR光谱采集。安装配置设计允许晶体在?x^T、y^T和?z^T轴上进行正向旋转，如测角器上的凹槽图案所示。测角器机制和样品安装的细节已在文献中描述。

安装的样品通过测角器的蜗杆机制从0°旋转到180°，并通过调整探针底部的模拟微米刻度尺进行测量。为了减少回差误差，所有旋转均在一个方向上进行。对于¹⁷O通道，90度脉冲长度为4 μs，对于¹H通道，为2.5 μs。低频（¹⁷O）和高频（¹H）通道每隔一个角度至少手动重新调谐和重新匹配一次。所有光谱均在室温（约22°C）下采集，并使用空气冷却。

对于每个旋转轴，记录了200 kHz的光谱宽度和0.02秒的采集时间（l-丙氨酸）和100 kHz的光谱宽度和0.04秒的采集时间（d-丙氨酸）。每张光谱收集了256到512次瞬态，以保持一致的信噪比（SNR）。旋转模式通过观察记录的共振频率之间的平滑曲线以及起始和结束旋转位置的光谱，以及关键检查点（如0°（?x^T） = 0°（y^T）、90°（?x^T） = 90°（?z^T）和0°（?z^T） = 90°（y^T）进行验证。光谱校准使用了外部参考样品，以水的¹⁷O化学位移定义为0.0 ppm。

在计算建模部分，使用了文献中的中子衍射晶体结构作为计算结构的基础。l-丙氨酸在60 K（278467.cif）和295 K（278464.cif）的结构，以及d-丙氨酸在60 K（278466.cif）的结构被用于计算。报告的d-丙氨酸在295 K的结构（278465.cif）被发现为l-对映异构体，因此通过翻转l-丙氨酸的c轴，创建了一个d-对映异构体的代理结构。60 K的d-丙氨酸结构中，N–C*–C角度相对于a轴的方向与l-丙氨酸结构相反，因此通过绕c轴旋转文献结构，获得了等效的计算起始点，其中两种对映异构体结构的主要差异在于手性碳上的氢和甲基的相对取向。所有晶体操作均使用VESTA进行。将中子结构.cif文件转换为CASTEP.cell输入文件使用了cif2cell。

尽管优化实验晶体结构是计算磁参数的常见做法，但我们还计算了未优化结构的电场梯度（EFG）和化学屏蔽张量，以实现与之前文献报告的直接比较。这些计算使用了rPBE泛函和PBEsol泛函，分别使用了650 eV和741 eV的截断能量，并采用了2 1 2 Monkhorst–Pack k点网格（见支持信息）。

丙氨酸对映异构体的EFG和屏蔽张量通过使用ultrasoft赝势和GIPAW方法（如CASTEP-NMR包中实现的）进行计算。然后使用上述方程（8–11）和（12–14）计算NMR参数，并通过方程（16）确定两个张量的相对取向。为了比较，EFG和屏蔽张量也使用优化的中子结构进行计算（见支持信息）。这些计算在3D周期性边界条件下进行，使用了CASTEP软件包，采用了PBEsol交换-相关泛函，并使用了“精确”的基组精度和自动有限基组校正。此外，还使用了Tkatchenko-Scheffler半经验色散校正。平面波截断能量为741 eV，同样使用了2 1 2 Monkhorst–Pack k点网格。在优化过程中，固定了晶胞参数，允许原子位置放松。实验与优化结构之间的微小差异总结为根均方位移（见表2）。

表2总结了优化后的实验参数，包括它们的误差，并列出了之前实验研究中使用粉末样品获得的¹⁷O和¹⁴N核的四极耦合和化学屏蔽各向异性参数。在实验中，我们观察到两种对映异构体的参数与计算值之间有良好的相关性。然而，一些差异仍然存在，即使在95%置信区间内。特别是，C_Q和δ_CS在至少一个位点上存在分歧。对于C_Q，最大的偏差出现在O1位点，其中l-对映异构体的计算值比实验值高约24%，而d-对映异构体的计算值比实验值高约14%。类似的趋势已经在之前的¹⁷O研究中被报道。对于δ_CS，即CSA张量的不对称参数，最大的差异同样出现在O1位点，其中l-丙氨酸的计算值比实验值高63%，而d-丙氨酸的计算值比实验值高50%。由于NMR参数对化学环境敏感，O1位点的较弱氢键环境（仅参与一个C═O···H–N氢键）可能贡献了实验值与DFT计算值之间的差异。

表5还列出了C_Q、η_Q和δ_iso的值，这些值来自之前使用粉末样品的实验研究。本研究中获得的SCNMR实验η_Q值与MAS和DAS测量值有良好的一致性。然而，与MQMAS测量值存在明显差异，尽管MQMAS测量值也与其他研究和本研究的计算结果存在差异。相比之下，本研究报告的DFT计算的NMR参数与大多数实验结果相符。

C_Q和δ_iso被确认为可靠参数，用于分配O1和O2位点。鉴于实验C_Q值的几乎相同且相对较大的不确定性，以及我们无法确定其中一个l-丙氨酸位点的95%置信区间，我们转向使用不对称参数η_Q进行位点分配。这个参数特别有用，因为它已知会随着氢键强度的增加而增加。

欧拉角α、β和γ与本研究中计算的值相比，两者都表现出良好的一致性。特别是，角度β和γ与两种对映异构体的计算值相符。另一个角度α表现出最大的统计不确定性，这与对称性参数η_CS的不准确测量有关，实验η_CS值的统计不确定性在11%到100%之间变化。由于四极和CSA主轴方向的潜在模糊性，必要时将欧拉角旋转了180°以允许直接比较。将四极张量主轴框架（PAF(Q)）与晶体轴框架之间的欧拉角（ζ、λ、ν）使用了以下关系计算：

R(ζ, λ, ν) = R^?1(α, β, γ) R(α_QG, β_QG, γ_QG)

其中，欧拉三元组（α、β、γ）将晶体轴框架与测角器框架联系起来，并通过X射线衍射确定。欧拉三元组（α_QG、β_QG、γ_QG）给出了PAF(Q)与测角器框架的取向。两组欧拉角均报告在表6和表7中。

除了传统的CSA和四极张量值，我们的DFT计算还产生了¹⁷O和¹⁴N核的非对称化学屏蔽张量分量，如表8至表10所示。这些表格揭示了¹⁷O和¹⁴N核的非对称化学屏蔽张量分量之间的关系，例如σ_yz^ACS（L） = ?σ_zy^ACS（R）以及σ_yz^ACS（L） = ?σ_zy^ACS（R）在两种对映异构体之间。这证实了两种对映异构体在xy平面上的镜像对称电子环境。

我们的发现表明，结合SCNMR光谱与DFT计算对于区分对映异构体之间的电子环境差异具有实用性。这种能力突显了SCNMR在研究手性分子系统，如氨基酸方面的潜力。未来的研究可能集中于分析对映异构环境中的¹⁷O核的所有卫星跃迁，以通过四极-ACS相互作用实验访问ACS贡献。这些相互作用可以在单晶ssNMR光谱的角依赖旋转模式中产生可观察的特征，除了传统的第一和第二阶四极和CSA效应。此外，我们建议将这种方法扩展到在更高磁场下的¹⁴N SCNMR，以提高灵敏度和分辨率，从而更清晰地观察四极展宽和磁屏蔽各向异性。这些研究可以提供关于非对称屏蔽效应的更深入见解，并探讨其在手性选择机制中的潜在作用，为碳质球粒陨石中观察到的l-氨基酸富集提供合理的解释，从而增进我们对天体环境中前生物化学的理解。