iPSC来源小细胞外囊泡通过靶向CISH-STAT3通路延缓自然杀伤细胞衰老并增强其抗肿瘤功能

《Stem Cell Research & Therapy》：iPSCs derived sEVs ameliorate NK cell senescence by targeting CISH-STAT3

本研究聚焦于衰老相关免疫衰退中自然杀伤（NK）细胞功能下降的关键问题。研究人员系统探讨了诱导多功能干细胞来源的小细胞外囊泡（iPSC-sEVs）对衰老NK细胞的 rejuvenation 作用及其机制。结果显示，iPSC-sEVs通过抑制CISH表达、促进STAT3磷酸化，有效改善NK细胞衰老表型，增强其细胞毒性（NKCC）和体内抗肿瘤能力。该研究为老年癌症及其他免疫衰老相关疾病提供了新型细胞free治疗策略。

　　

随着全球人口老龄化进程加速，年龄相关性疾病已成为重大公共卫生挑战。免疫系统的衰老（immunosenescence）是这一过程中的核心环节，其特征是免疫功能的渐进性衰退，导致老年人感染、慢性炎症疾病和癌症的易感性显著增加。作为先天免疫系统的关键效应细胞，自然杀伤（Natural Killer, NK）细胞在肿瘤免疫监视中扮演着不可或替代的角色。然而，与适应性免疫细胞不同，NK细胞的功能随年龄增长而显著下降，这一现象被称为NK细胞衰老，其具体机制尚不完全清楚，且缺乏有效的干预手段。

近年来，干细胞疗法在抗衰老领域展现出巨大潜力。诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）因其具有类似于胚胎干细胞的无限自我更新和多向分化潜能，且规避了伦理问题，成为再生医学的研究热点。更引人注目的是，干细胞旁分泌的关键介质——小细胞外囊泡（small extracellular vesicles, sEVs），作为一种无细胞的治疗剂，在多种年龄相关性疾病模型中显示出 rejuvenation 作用。那么，iPSC来源的sEVs（iPSC-sEVs）能否逆转NK细胞的衰老状态？其背后的分子机制又是怎样的？这正是上海交通大学医学院附属第六人民医院研究团队在《Stem Cell Research & Therapy》上发表的最新研究旨在解答的核心科学问题。

为探究此问题，研究人员综合运用了多种关键技术方法。研究主体采用了12月龄自然衰老C57BL/6J雄性小鼠模型，通过尾静脉每周注射iPSC-sEVs（1x10¹⁰/ml颗粒，100μl/只）持续6个月；同时，在体外利用D-半乳糖（D-gal）诱导人NK92细胞建立细胞衰老模型。关键实验技术包括：流式细胞术分析细胞表型与亚群、共接种肿瘤模型（B16黑色素瘤细胞与脾源性NK细胞皮下共注射）评估体内抗肿瘤功能、RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析、蛋白质印迹（Western blot）检测蛋白表达与磷酸化、慢病毒转染构建CISH过表达细胞系，以及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对iPSC-sEVs进行蛋白质组学分析。

iPSC-sEVs改善了衰老小鼠脾脏NK细胞的衰老表型并增强了体外细胞毒性

研究人员首先在自然衰老的小鼠模型中验证了iPSC-sEVs的干预效果。与年轻小鼠相比，衰老（Old-PBS）小鼠表现出毛发状态差、体重增加等一般衰老特征，而iPSC-sEVs干预组则更接近年轻小鼠状态。

通过对脾脏组织的分析发现，衰老小鼠脾脏中DNA损伤标志物γH2AX和衰老相关蛋白p21的表达显著升高，衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性增加。更重要的是，p21与成熟NK细胞标志物CD122的双重免疫荧光染色证实，衰老小鼠的脾脏NK细胞确实呈现出衰老表型。流式细胞术分析显示，衰老NK细胞中抑制性受体KLRG1和NKG2C的表达上调，这与老年人群体研究中观察到的NK细胞表型变化一致。体外细胞毒性实验进一步表明，从衰老小鼠脾脏分离的NK细胞对YAC-1淋巴瘤细胞的杀伤能力明显减弱。而经过6个月的iPSC-sEVs干预后，这些衰老相关指标均得到显著改善：衰老标志物表达下降，抑制性受体表达减少，细胞毒性功能恢复。体内示踪实验证实，脾脏NK细胞能够有效摄取iPSC-sEVs，为其直接作用提供了依据。

iPSC-sEVs增强衰老NK细胞在体内共接种模型中的细胞毒功能和招募能力

为了评估iPSC-sEVs干预后NK细胞的生理功能，研究人员设计了一项巧妙的实验：将从年轻、衰老PBS处理和老iPSC-sEVs处理小鼠脾脏纯化的NK细胞，与B16黑色素瘤细胞按5:1的比例皮下共接种至同系C57小鼠体内。

结果显示，与衰老PBS组相比，接受iPSC-sEVs干预的衰老NK细胞（Old-iPSC-sEVs NK）能够更有效地抑制肿瘤生长，肿瘤体积和重量显著减小。免疫组化分析表明，iPSC-sEVs组肿瘤组织中残留的NK细胞（NCR1+）更多，肿瘤细胞增殖标志物Ki67阳性率降低，而凋亡标志物cleaved caspase-3阳性率升高。流式细胞术对肿瘤浸润免疫细胞的分析进一步揭示，iPSC-sEVs干预组的NK细胞不仅自身抗肿瘤能力增强，还能招募更多的CD4+和CD8+T细胞至肿瘤部位，表明其改善了衰老NK细胞的免疫调节功能。同时，肿瘤内NK细胞表面KLRG1和NKG2C的表达也显著降低，与体外实验结果一致。

iPSC-sEVs改善D-gal诱导的NK92细胞衰老并增强抗肿瘤活性

为深入探讨机制，研究团队在体外建立了D-半乳糖（D-gal）诱导的人NK92细胞衰老模型。与体内实验结果一致，D-gal处理导致NK92细胞出现典型的衰老特征：细胞周期阻滞、DNA损伤标志物γH2AX和p53蛋白表达上调、CD56^bright亚群减少而CD16^dimNKG2C+和KLRG1+亚群增加，以及对K562肿瘤细胞的细胞毒性减弱。

iPSC-sEVs的干预显著逆转了这些衰老表型，恢复了细胞增殖能力，降低了衰老标志物表达，改善了NK细胞亚群分布，并增强了细胞毒性功能。这表明iPSC-sEVs在人类NK细胞系中也具有明确的抗衰老作用。

转录组分析揭示iPSC-sEVs调节D-gal介导的衰老NK92细胞的基因表达模式

通过对不同处理组NK92细胞进行RNA测序分析，研究人员深入探索了iPSC-sEVs作用的分子机制。基因本体（GO）富集分析显示，D-gal干预影响了NK细胞的多种生物学过程和分子功能。

KEGG通路分析表明，iPSC-sEVs与D-gal处理组之间的差异表达基因显著富集于TNF信号通路、T细胞受体信号通路和JAK-STAT信号通路。基因集富集分析（GSEA）进一步提示，炎症相关通路在D-gal诱导的衰老过程中被激活。特别值得注意的是，细胞因子诱导的SRC同源2结构域包含蛋白（Cytokine-inducible SH2-containing protein, CISH）的表达在D-gal处理的衰老细胞中上调，而iPSC-sEVs干预则使其恢复正常水平。String蛋白互作网络分析显示，CISH与STAT3及NK细胞功能相关分子存在密切关联。

iPSC-sEVs通过激活CISH-STAT3信号通路改善D-gal介导的NK92细胞衰老

为验证CISH在NK细胞衰老中的直接作用，研究人员构建了CISH过表达的NK92细胞系。结果显示，CISH过表达诱导了明显的衰老表型：p21和γH2AX表达升高，CD56^bright亚群减少，NKG2C+和KLRG1+亚群增加，细胞毒性功能下降。机制上，CISH过表达抑制了STAT3的磷酸化水平。

相反，使用STAT3抑制剂（STAT3-in-12）处理NK细胞，可模拟D-gal诱导的衰老表型；而STAT3激动剂（Broussonin E）则能 ameliorate D-gal引起的衰老。更重要的是，当同时使用iPSC-sEVs和STAT3抑制剂处理D-gal诱导的衰老NK92细胞时，iPSC-sEVs的 rejuvenation 作用被取消，证明iPSC-sEVs确实通过CISH-STAT3通路发挥抗衰老作用。在体内实验中，从年轻、衰老PBS处理和衰老iPSC-sEVs处理小鼠分离的原代NK细胞也证实，iPSC-sEVs干预能够逆转衰老引起的CISH表达上调。

iPSC-sEVs蛋白质协同调节D-gal诱导的NK92衰老模型中CISH-STAT3通路的表达

为阐明iPSC-sEVs调控CISH表达的具体机制，研究人员对其蛋白质组成进行了质谱分析。KEGG分析显示，iPSC-sEVs中的蛋白质参与多种生物通路，包括代谢、RNA降解和长寿调节通路。

GO富集分析发现，iPSC-sEVs内容物高度富集RNA结合蛋白（RNA-binding proteins, RBPs）和蛋白酶体成分。通过生物信息学预测，在CISH的223个潜在RBPs中，有149种也存在于iPSC-sEVs中。KEGG聚类分析表明，这些蛋白与剪接体、mRNA监视和RNA降解通路相关。研究人员推测，iPSC-sEVs可能通过递送这些RBPs，在转录后水平调控CISH mRNA的稳定性或翻译效率，从而降低CISH表达。这一发现与既往研究报道的m⁶A甲基化修饰调控CISH表达的结果相吻合。

研究结论与意义

本研究系统证实了iPSC-sEVs在延缓NK细胞衰老和增强其抗肿瘤功能方面的显著效果。机制上，iPSC-sEVs通过递送RNA结合蛋白等活性成分，抑制CISH的表达，进而促进STAT3磷酸化，最终改善NK细胞的衰老表型并增强其细胞毒性。这一发现不仅深化了对免疫衰老机制的理解，更重要的是为老年癌症患者及其他免疫衰老相关疾病的治疗提供了新思路。

作为细胞free的治疗剂，iPSC-sEVs规避了干细胞移植潜在的成瘤性和免疫排斥风险，具有更好的临床应用安全性。该研究首次将iPSC-sEVs的抗衰老作用拓展至NK细胞这一重要的先天免疫细胞类型，为开发基于iPSC-sEVs的免疫 rejuvenation 策略奠定了坚实的实验基础，有望成为改善老年癌症免疫治疗疗效的新突破点。