基于超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）的糖尿病合并高尿酸血症患者血浆非靶向脂质组学分析

《Frontiers in Molecular Biosciences》：UHPLC-MS/MS-based plasma untargeted lipidomic analysis in patients with diabetes mellitus combined with hyperuricemia

　　

目的：比较糖尿病合并高尿酸血症（diabetes mellitus combined with hyperuricemia, DH）患者与糖尿病（diabetes mellitus, DM）患者及健康对照者之间脂质代谢物的差异，并初步揭示DH中脂质代谢途径的变化。方法：采用现况研究方法，选取2019年6月至2020年7月中国福建省福州市18岁及以上常住居民中确诊的糖尿病患者及糖尿病合并高尿酸血症患者各17例，按性别和年龄1:1匹配，并随机选取17例健康对照者，采集空腹血样。采用基于超高效液相色谱-串联质谱（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UHPLC-MS/MS）技术的非靶向脂质组学分析，使用Student’s t检验和差异倍数（multiple of difference, FC）初步筛选差异脂质分子并确定其变化趋势；采用主成分分析（principal component analysis, PCA）和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA）观察两组样本的整体分布。最后使用Metabo Analyst 5.0平台分析差异脂质代谢途径。结果：研究人员共鉴定出30个亚类的1361个脂质分子。多变量分析显示DH、DM和正常糖耐量（normal glucose tolerance, NGT）组间存在显著分离趋势，证实其具有不同的脂质组学特征。与NGT对照组相比，DH组中共有31种显著改变的脂质代谢物被确定。在最相关的个体代谢物中，13种甘油三酯（triglycerides, TGs）如TG (16:0/18:1/18:2)、10种磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamines, PEs）如PE (18:0/20:4)以及7种磷脂酰胆碱（phosphatidylcholines, PCs）包括PC (36:1)显著上调，而1种磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol, PI）下调。对这些代谢物组的综合分析显示其富集于6条主要代谢途径。关键的是，影响值（impact value）为0.199的甘油磷脂代谢（glycerophospholipid metabolism）和影响值为0.014的甘油酯代谢（glycerolipid metabolism）被确定为DH患者中受扰动最显著的途径。此外，DH与DM组的比较识别出12种差异脂质，也主要富集于这些相同的核心途径，强调了其在高尿酸血症合并糖尿病病理生理学中的核心作用。结论：糖尿病合并高尿酸血症患者与糖尿病患者及健康对照者相比，脂质代谢物发生显著改变。共鉴定出31种显著差异的脂质分子，并发现DH患者存在甘油磷脂代谢和甘油酯代谢途径的异常。

该研究发表于《Frontiers in Molecular Biosciences》。研究背景方面，糖尿病（diabetes mellitus, DM）是以高血糖为特征的慢性代谢性疾病，全球患病率持续上升，易导致多器官慢性病变。血尿酸是嘌呤核苷酸分解代谢产物，高尿酸血症（hyperuricemia）在中国患病率已达17.7%，且常与糖尿病共病，血清尿酸每升高1 mL/dL糖尿病风险增加17%，并与糖尿病肾病、心血管事件等并发症密切相关。糖尿病与高尿酸血症均为代谢疾病，常伴脂质异常，但常规临床指标如BMI、空腹血糖、HbA1c及传统生化检测无法全面捕获疾病相关的早期脂质紊乱，基因表达谱受环境遗传异质性限制也难以探索其分子机制，因此亟需新方法阐明糖尿病合并高尿酸血症的发生机制。研究人员采用基于超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）的非靶向脂质组学技术，表征糖尿病及糖尿病合并高尿酸血症患者的血浆脂质代谢谱，识别差异表达脂质分子并富集代谢途径，以阐明脂质分子在检测糖尿病及糖尿病合并高尿酸血症发展中的潜在作用，最终鉴定出31种显著差异脂质分子，明确甘油磷脂代谢和甘油酯代谢是DH患者最显著扰动的途径，这些发现为深入理解该共病病理生理机制及开发潜在生物标志物提供了脂质层面的证据。

作者开展研究用到的主要关键技术方法包括：研究对象为2019年至2020年中国福建省福州市18岁及以上常住居民，按1:1匹配病例对照设计选取糖尿病组、糖尿病合并高尿酸血症组各17例及17例健康对照。采用UHPLC-MS/MS进行血浆非靶向脂质组学检测，通过Student’s t检验和差异倍数（FC）筛选差异脂质分子，运用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）观察样本整体分布，利用LipidSearch进行脂质鉴定与提取，借助Metabo Analyst 5.0平台结合京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库进行差异脂质代谢途径分析，筛选标准为变量权重值（VIP）>1、P < 0.05且FC > 1.5或< 0.67。

研究结果部分保留原文小标题并总结如下：

3 Results。研究人员首先展示一般人群特征，三组在年龄、性别、婚姻、教育、职业、糖尿病史、吸烟、饮酒、睡眠及运动方面无统计学显著差异（P > 0.05），组间均衡可比。

3.2 Experimental quality control。通过分析质控（QC）样本基峰色谱图（BPC）叠加及相关图，观察到血浆不同类别脂质代谢物明显分离，所有QC样本峰响应强度与保留时间一致，证明仪器稳定性高、实验重复性好、数据可靠。

3.3 Analysis of lipid components。使用Lipid Search软件分析，共鉴定30个脂质亚类1361个脂质分子，其中甘油磷脂621种、甘油酯388种、鞘脂314种、其他脂质38种。

3.4 Multivariate statistical analysis of lipid molecules。3.4.1 Principal component analysis（PCA）。PCA显示DH与NGT、DH与DM组样本分离良好，DH vs. NGT的R²X = 0.552，DH vs. DM的R²X = 0.509，均大于0.5，模型可靠。

3.4.2 Orthogonal partial least squares discriminant analysis（OPLS-DA）。OPLS-DA进一步验证分离趋势，DH vs. NGT的R²Y = 0.380、Q² = 0.551，DH vs. DM的R²Y = 0.682、Q² = 0.167，置换检验显示原始模型无过拟合，稳健可靠。

3.5 Analysis of plasma lipid molecular differences among the three groups。以FC > 1.5或< 0.67、P < 0.05筛选，DH vs. NGT中405种脂质分子上调、15种下调；DH vs. DM中118种上调、22种下调。

3.6 Clustering analysis of differential lipid molecules in the three populations。结合VIP >1筛选，DH vs. NGT有73种显著上调脂质分子，DH vs. DM有34种显著改变（27上调、7下调）。DH vs. NGT鉴定31种显著差异脂质（13种TG、10种PE、7种PC、1种PI下调），DH vs. DM鉴定12种（10种TG、2种PC）。层次聚类显示DH组差异脂质水平普遍高于NGT，分组明显可重复。

3.7 Analysis of plasma differential lipid molecule metabolic pathways。Metabo Analyst 5.0分析31种差异脂质，富集于6条途径：甘油磷脂代谢（影响值0.199）、亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢、糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol, GPI）锚生物合成、甘油酯代谢（影响值0.014）、花生四烯酸代谢。PC和PE主要参与甘油磷脂代谢，TG主要参与甘油酯代谢。DH vs. DM的12种脂质富集于甘油磷脂代谢（影响值0.094）和甘油三酯代谢（影响值0.014），PC主要参与甘油磷脂代谢。

讨论部分总结：研究人员指出本研究利用非靶向脂质组学揭示DH患者脂质代谢物特征，PCA与OPLS-DA显示三组分离明显，结合VIP>1等条件鉴定73种差异代谢物，进一步确定31种可识别差异脂质，途径分析显示DH与甘油磷脂及甘油酯代谢显著相关，PC、PE参与甘油磷脂代谢，TG参与甘油酯代谢，可作为潜在生物标志物。甘油磷脂是哺乳动物细胞膜主要脂质，PC/PE比影响胰岛素信号，本研究DH患者7种PC和10种PE异常升高提示甘油磷脂代谢异常，既往研究亦表明PC、PE与糖尿病风险正相关，高尿酸血症体内外研究也发现甘油磷脂途径扰动及LPCAT3可能为关键调节因子。TG是脂肪酸储存运输形式，过量释放致胰岛素抵抗，其影响DH机制可能涉及炎症、氧化应激及胰岛素信号。研究局限性包括每组样本量较小、横断面设计、多中心采血可能存在批次效应但经标准化缓解、未测饮食药物等环境因素、样本限于福建人群外推受限。

结论部分翻译：综上所述，本研究通过UHPLC-MS/MS技术共鉴定出31种作为DH潜在生物标志物的显著差异脂质代谢物，它们富集于甘油磷脂代谢、亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢、糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚生物合成、甘油酯代谢及花生四烯酸代谢途径。其中甘油磷脂和甘油酯代谢途径最为重要。PC和PE主要参与甘油磷脂代谢途径，TG与甘油酯代谢途径密切相关。

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