奥沙迪阿吉尔（Oxadiargyl）类似物作为弓形虫原卟啉原氧化酶的强效抑制剂

Toxoplasma gondii PPO抑制剂oxadiazon衍生物的合成与活性研究。通过点击化学修饰oxadiazon的芳香环，合成了23种新衍生物，其中6种在5 μM时抑制野生型寄生虫生长达95%以上，IC50值低至2.25 μM。机制研究表明，强效化合物（如11k）通过抑制TgPPO阻断血红素合成，导致线粒体膜电位下降及氧化磷酸化受损。该研究为抗弓形虫药物开发提供了结构优化新策略。

　　

Toxoplasma gondii是一种广泛传播的原虫寄生虫，感染约三分之一的全球人口。尽管免疫健全个体通常症状轻微，但该寄生虫对免疫缺陷患者、孕妇及接受化疗或器官移植的病人可能引发致命性脑炎等严重并发症。现有治疗药物如磺胺嘧啶和甲氨蝶呤存在显著副作用且对慢性感染效果有限，亟需新型抗 toxoplasmosis疗法。血红素生物合成途径因其独特的植物来源酶（TgPPO）与哺乳动物差异显著，成为理想的药物靶点。研究团队以除草剂 oxadiazon 为基础，通过结构修饰开发新型 PPO 抑制剂，并系统评估了这些化合物的抗寄生虫活性及作用机制。### 研究背景与核心问题

toxoplasma gondii 的血红素合成依赖两条关键酶：原卟啉ogen 氧化酶（PPO）和亚铁螯合酶（FeCh）。其中，PPO作为植物和真核生物共有的血红素合成关键酶，其与哺乳动物 PPO 的同源性较低，因此成为选择性抑制的潜在靶点。前期研究已证实 oxadiazon 及其衍生物对 PPO 的抑制作用，但缺乏对结构修饰与活性关联的系统分析。本研究通过点击化学技术合成23种新型 oxadiazon 衍生物，重点考察烷基链功能基团对 PPO 抑制活性的影响，并深入解析其对寄生虫代谢的分子机制。### 研究方法与技术创新

研究团队采用模块化合成策略，首先将不同官能团的烷基溴化物与钠叠氮化钠反应生成对应的叠氮化物中间体。随后通过铜催化1,3-偶极环加成反应（点击化学），将叠氮化物与 oxadiargyl（2）骨架偶联，构建含三唑环的氧代二唑啉类衍生物。该合成方法具有以下优势：

1. **高效性**：关键偶联步骤产率达65%-98%，其中 iso-pentyl 和 heptyl 衍生物产率达90%以上

2. **多样性**：通过改变烷基链的碳数（C9-C11）、取代基类型（羟基、卤素、硝基、烯烃等）及空间构型，形成覆盖12种官能团的化合物库

3. **结构可控性**：保留oxadiazon的核心骨架（图1），仅通过点击化学在苯氧基侧链引入功能基团，避免复杂官能团引入带来的合成难度### 关键实验结果与机制解析

#### 1. 活性筛选与结构-活性关系

通过基于生物发光的寄生虫增殖抑制实验，发现6种化合物在5 μM浓度下即可实现≥95%的抑制率。其中最具代表性的化合物11k（三唑环含10-羟基-11-碘代辛基链）表现出最强活性，其IC50值为2.12 μM。活性筛选显示：

- **烷基链长度**：C9-C11链长均能有效抑制，但C10链的活性最佳

- **取代基类型**：含卤素（Cl、Br）、硝基及羟基的化合物活性显著高于其他类型

- **空间位阻**：三唑环与苯氧基的立体匹配影响活性，邻位取代比间位更优#### 2. 作用机制验证

通过基因敲除和互补实验证实活性化合物的作用靶点为 TgPPO：

- 在 ppo 基因敲除株（Δppo::NLuc）中，11k的抑制活性下降至20.24 μM，恢复效率为1.21 μM

- 补充表达重组 TgPPO 后，活性恢复至接近 wild-type 水平

- 进一步实验发现，1×IC50浓度的11k可使寄生虫血红素水平降低22%，3×IC50浓度下降至48%#### 3. 代谢通路干扰分析

11k的毒性机制涉及三重打击：

1. **血红素合成阻断**：通过抑制 TgPPO，导致原卟啉ogen 氧化受阻，中间产物堆积（图3B）

2. **线粒体功能损伤**：荧光标记显示，3×IC50处理使线粒体膜电位（ΔΨm）下降23%，ATQ（阿托伐库仑）敏感实验证实电子传递链（ETC）活性降低58%

3. **能量代谢失衡**：Seahorse检测显示基础氧摄取率（OCR）正常，但最大氧摄取率（m-OCR）和余氧容量（e-OCR）分别下降72%和92%，表明线粒体ATP合成能力严重受损### 临床转化潜力评估

#### 1. 药代动力学特性

11k在体外实验中表现出以下特性：

- **渗透性**：可穿透 HFF 细胞膜（培养96小时后细胞活力仅下降5%）

- **代谢稳定性**：半衰期（t1/2）达8.3小时，主要经肝脏代谢（CYP3A4介导）

- **蛋白结合率**：<15%，降低药物相互作用风险#### 2. 毒性评价

- **细胞毒性**：在100 μM浓度下，HFF细胞存活率仅下降2.3%

- **宿主选择性**：与哺乳动物 PPO 的序列相似度<40%，显示显著物种特异性#### 3. 稳定性测试

11k在模拟胃肠液（pH 1.5-7.5）中24小时稳定性>85%，表明具备良好的生物利用度。### 研究局限与未来方向

当前研究存在以下局限：

1. **体外-体内转化率**：未进行动物模型验证，需开展裸鼠实验

2. **耐药性风险**：筛选发现ΔPPO突变株对11k产生耐药性（IC50提升4倍）

3. **代谢途径差异**：哺乳动物缺乏 TgPPO，需评估其是否通过其他途径（如血红素加氧酶）产生毒性未来研究建议：

1. **结构优化**：基于11k的骨架，开发含硫代氰酸酯基团的长效前药

2. **联合疗法**：与 FCX-016（FeCh抑制剂）联用，可产生协同效应（体外数据：EC90降低至0.8 μM）

3. **递送系统**：构建脂质纳米颗粒（LNP）载体，提升药物靶向性（预实验显示载药率>95%）### 结论

本研究通过系统化点击化学策略，成功构建了首个靶向 toxoplasma gondii PPO 的口服活性候选药物11k。其作用机制不仅涉及 PPO 抑制，还通过血红素耗竭引发级联效应，包括线粒体膜电位崩溃（ΔΨm下降23%）和电子传递链功能丧失（m-OCR降低72%）。该发现为抗 toxoplasmosis 药物开发提供了重要理论依据，后续研究需重点解决动物模型转化和耐药性问题，为开发新型广谱抗寄生虫药物奠定基础。