比较基因组分析确定FleQ和GcbB为烟草假单胞菌（Pseudomonas syringae pv. tabaci）菌株中的毒力相关因子

《Molecular Plant Pathology》：Comparative Genomic Analysis Identifies FleQ and GcbB as Virulence-Associated Factors in Pseudomonas syringae pv. tabaci Strains

单核苷酸多态性导致Pseudomonas syringae pv. tabaci毒力差异：比较基因组学揭示fleQ和gcbB基因通过调控 flagella motility和c-di-GMP信号通路影响生物膜形成及毒力。

　　该研究围绕一种重要的植物病原菌——烟草花叶病菌（*Pseudomonas syringae* pv. *tabaci*，简称Pta）的两种菌株，即高度致病的Pta6605和致病性较弱的Pta7375，展开探讨其致病力差异的遗传基础。研究通过比较基因组学的方法，识别出两者之间在基因层面的差异，并进一步分析这些差异对细菌致病能力的影响。结果表明，这些差异主要集中在两个关键的调控基因*fleQ*和*gcbB*上，它们在细菌的致病机制中扮演了重要角色。

Pta6605和Pta7375在基因组结构上高度相似，具有超过99%的核苷酸同源性，且基因排列保持一致。然而，研究人员通过深入分析发现，Pta7375中存在多个单核苷酸变异（SNPs）和提前终止密码子，这些变异主要影响了七个开放阅读框（ORFs）的功能。其中，两个关键基因*fleQ*和*gcbB*的点突变被特别关注，因为它们可能在调控细菌的致病能力方面起着核心作用。

*fleQ*基因编码一种转录因子，其结构包含Rec结构域、AAA+/ATPase结构域以及DNA结合的螺旋-转角-螺旋（HTH）结构域。该基因在其他*Pseudomonas*物种中已知参与调控鞭毛生物合成和生物膜形成。在Pta7375中，*fleQ*基因发生了一个单核苷酸插入突变，导致了框架移码，进而使得该基因的表达产物被截断，失去了其DNA结合能力。这种突变直接削弱了*fleQ*的调控功能，从而影响了与鞭毛相关的一系列基因的表达，包括*fliC*（编码鞭毛蛋白）、*flgA*和*fliL*等。这些基因的表达水平在Pta7375中显著下降，而当将Pta6605的*fleQ*基因引入Pta7375时，这些基因的表达得以恢复，说明*fleQ*在调控鞭毛形成和生物膜生成中具有关键作用。

*gcbB*基因则编码一种包含GGDEF结构域的二元鸟苷酸环化酶（DGC），该结构域在c-di-GMP（环二鸟苷酸）合成中发挥核心作用。c-di-GMP是一种细菌中的第二信使，能够调节细菌的运动性、生物膜形成和致病力。在Pta7375中，*gcbB*基因发生了一个框架移码突变，导致GGDEF结构域的缺失，从而影响了c-di-GMP的合成能力。尽管如此，*gcbB*的缺失在Pta6605中并未显著改变c-di-GMP的积累水平，这可能是因为Pta基因组中存在多个GGDEF结构域蛋白，这些蛋白可能具有一定的功能冗余。然而，当同时缺失*fleQ*和*gcbB*时，c-di-GMP水平显著下降，这种现象在Pta7375中同样存在，说明这两个基因的协同作用可能对c-di-GMP的调控至关重要。

研究进一步通过构建缺失突变体和基因替换突变体，验证了*fleQ*和*gcbB*在致病力调控中的具体作用。例如，当Pta6605中缺失*fleQ*时，其运动性、鞭毛蛋白积累、生物膜形成以及致病力均显著下降，与Pta7375的表型高度相似。这表明*fleQ*在Pta的致病过程中具有核心地位，其突变是导致Pta7375致病力减弱的主要原因。相比之下，*gcbB*的缺失对运动性和生物膜形成没有明显影响，但在某些条件下仍可能对致病力产生轻微影响。此外，当Pta6605的*gcbB*被替换为Pta7375的同源基因时，其致病力未明显恢复，这表明*gcbB*的作用可能不如*fleQ*显著。

进一步的实验还揭示了*fleQ*和*c-di-GMP*信号通路之间的相互作用。*fleQ*通过调控c-di-GMP合成相关基因的表达，间接影响c-di-GMP的水平。在Pta6605中，当*fleQ*被缺失时，c-di-GMP的积累显著减少，这可能是因为*fleQ*在调控其他DGC基因方面发挥着重要作用。因此，*fleQ*不仅是鞭毛形成的调控因子，还通过影响c-di-GMP的水平，间接调控细菌的生物膜形成和致病能力。

研究还探讨了这些基因突变在自然环境中的潜在意义。由于农业实践中通常会移除表现出明显病害症状的植物，这可能导致了低致病力菌株的自然选择。此外，植物免疫系统对鞭毛蛋白（如FliC）的识别是病原菌致病的关键环节之一。因此，*fleQ*的突变可能导致鞭毛蛋白的减少，从而降低病原菌被宿主识别和防御的可能性。这一现象在一些其他病原菌中也有所体现，即低致病力菌株可能在宿主内部具有更高的生存优势。

此外，研究还指出，生态学理论认为，当病原菌的传播依赖于温和的、长期的定植而非剧烈的病斑扩散时，较低的致病力可能是有利的。因此，*fleQ*的突变不仅影响了细菌的运动性和生物膜形成，还可能对其在植物中的生存策略产生了深远影响。

通过基因替换实验，研究人员发现*fleQ*突变是导致Pta7375致病力下降的主因，而*gcbB*的突变则仅对致病力产生次要影响。这些发现不仅揭示了Pta菌株之间致病力差异的遗传基础，还为理解植物病原菌的调控网络提供了新的视角。研究强调，利用比较基因组学技术，可以有效解析病原菌在不同宿主和环境条件下如何通过基因变异来调整其致病策略，这对于开发新的病害防控方法具有重要意义。

总之，这项研究通过基因组比较和功能分析，揭示了*fleQ*和*gcbB*在Pta致病力调控中的关键作用。特别是*fleQ*的突变对细菌的运动性、鞭毛形成、生物膜积累和致病力的显著影响，为后续研究提供了明确的方向。这些结果不仅有助于理解Pta的致病机制，还可能为其他植物病原菌的研究提供参考，推动对病原菌调控网络的深入探索。