基于TaqMan技术的一步四重逆转录实时PCR（RT-qPCR）方法的开发与应用：用于四种猪腹泻病毒的差异检测

《Transboundary and Emerging Diseases》：Development and Application of a TaqMan-Based One-Step Quadruplex Reverse Transcription Real-Time PCR (RT-qPCR) for Differential Detection of Four Porcine Diarrhea Viruses

本研究开发了一种基于TaqMan的四重一步实时荧光定量逆转录PCR（RT-qPCR）方法，用于同时检测和鉴别PEDV、TGEV、PDCoV和PoRVA。该方法灵敏度达10^1.5 TCID50/mL，特异性分析显示无交叉反应，重复性良好（CV 0.09%-2.09%）。临床检测348份样本显示PEDV（43.68%）、PoRVA（33.91%）和PDCoV（26.44%）为主要病原，混合感染率达14.37%。该方法与单重PCR检测结果一致率高达99.43%，适用于临床诊断和流行病学调查。

猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪δ冠状病毒（PDCoV）和猪轮状病毒A群（PoRVA）是引起猪病毒性腹泻的主要病原体。这些病毒在临床上表现出相似的症状，如呕吐、腹泻和脱水，这使得在实际诊断中难以区分。因此，迫切需要一种高灵敏度和高特异性的诊断方法，以准确识别这些病原体。本研究中，我们开发了一种基于TaqMan探针的一步法四重逆转录实时PCR（RT-qPCR）检测方法，用于同时和特异性检测这四种病毒。通过使用标准曲线，我们发现相关系数（R2）在10?.?至102.? TCID??/mL的动态范围内均超过了0.990，且扩增效率在90%至110%之间。该方法的检测限（LOD）为101.? TCID??/mL。特异性分析显示，该方法不会与其他相关病原体发生交叉反应。重复性测试表明，该方法在室内和室间检测中变异系数（CVs）分别在0.15%至1.41%和0.09%至2.09%之间，说明该方法具有良好的重复性。此外，该方法在348个临床粪便样本中进行了实际应用测试，结果显示PEDV、TGEV、PDCoV和PoRVA的阳性率分别为43.68%、0.57%、26.44%和33.91%。同时， PEDV与PDCoV的共感染率为14.37%， PEDV与PoRVA的共感染率为13.51%， PDCoV与PoRVA的共感染率为2.01%，以及 PEDV、PDCoV和PoRVA的三重感染率为5.75%。与单重RT-qPCR相比，四重方法在检测这些病原体时显示出99.41%至100%的一致性率。因此，本研究开发的四重RT-qPCR方法为猪病毒性腹泻的临床诊断、疾病监测和流行病学研究提供了一种可靠、灵敏和准确的工具。

猪病毒性腹泻对全球养猪业造成严重经济损失，尤其是对仔猪的影响尤为显著。这种疾病通常由多种病毒引起，包括猪肠道冠状病毒和猪轮状病毒，其中PEDV、TGEV、PDCoV和PoRVA是主要的病原体。随着集约化养殖的迅速发展，这些病毒之间的共感染或继发感染现象变得越来越普遍，从而导致更高的发病率和死亡率。由于这些病毒在临床表现上非常相似，仅凭临床症状难以准确鉴别，因此开发一种快速且可靠的诊断方法显得尤为重要。

在本研究中，我们设计了针对这四种病毒的特异性引物和探针，这些引物和探针基于其基因组中保守的区域。具体来说，针对PEDV、TGEV和PDCoV的引物和探针设计在它们的N基因上，而针对PoRVA的引物和探针则设计在其VP6基因上。考虑到PoRVA的VP6基因中存在一些碱基突变，我们在设计过程中引入了退化碱基（如R、H和Y），以提高检测效率。这些探针分别被FAM、ROX、Cy5和VIC标记，并以BHQ1或BHQ3作为淬灭基团。引物和探针的序列如表1所示，并由上海生工生物技术有限公司合成。

为了评估该方法的性能，我们使用了病毒RNA标准混合物，这些标准混合物由四种病毒在10?.? TCID??/mL浓度下等比例混合而成。随后，通过10倍梯度稀释，我们获得了从10?.?到10?.? TCID??/mL的RNA浓度范围。在优化的反应条件下，使用ABI7500实时PCR系统进行了标准曲线的建立，结果显示标准曲线具有良好的线性关系（R2≥0.990）和扩增效率（90%至110%）。此外，我们还进行了特异性分析，使用了其他常见的猪病原体（如PRRSV、CSFV、PRV、PPV、PCV2、GETV、PSV、PTV和PoNoV）的核酸作为模板，结果表明该方法能够特异性地检测出目标病毒，而不会与其他病毒产生交叉反应。

为了进一步验证该方法的灵敏度，我们对不同浓度的病毒RNA标准混合物进行了检测，结果表明该方法的检测限为101.? TCID??/mL。同时，我们进行了重复性测试，使用不同浓度的病毒RNA标准混合物（10?.?、10?.?和102.? TCID??/mL）在单次实验中重复检测（室内重复）和三次独立实验中检测（室间重复），结果表明该方法在室内和室间重复检测中均表现出良好的一致性。

在实际应用中，我们使用了348个来自中国多个省份的临床粪便样本（江苏184个，上海41个，安徽23个，河南47个，四川18个，湖南35个）进行检测。这些样本均来自发生仔猪腹泻或呕吐疫情的猪场。检测结果显示，PEDV、TGEV、PDCoV和PoRVA的阳性率分别为43.68%、0.57%、26.44%和33.91%。此外，这些样本还通过单重RT-qPCR方法进行了检测，结果表明两种方法之间的一致性率均超过99%，说明四重方法可以有效替代单重方法，实现对这四种病毒的同时检测。

值得注意的是，TGEV的阳性率相对较低，仅为0.57%，这与之前报道的0.2%至3.91%的流行率一致。这可能表明TGEV在某些猪场中已被其变异株猪呼吸道冠状病毒（PRCV）所取代，该变异株因缺失S基因而改变了组织亲嗜性。此外，PRCV的感染率达到了11.8%，表明其在中国的猪场中具有较高的流行性。因此，TGEV的低阳性率可能与PRCV的广泛传播有关。

在本研究中，我们还发现这四种病毒之间的共感染情况较为常见，其中PEDV与PDCoV的共感染率最高，达到14.37%，其次是PEDV与PoRVA的共感染率13.51%，PDCoV与PoRVA的共感染率为2.01%，而三重感染（PEDV、PDCoV和PoRVA）的感染率为5.75%。这些结果表明，猪场中引起病毒性腹泻的病原体种类复杂，共感染现象普遍，因此需要一种能够同时检测多种病原体的诊断方法。

综上所述，本研究开发的四重RT-qPCR方法在灵敏度、特异性和重复性方面均表现出色，能够有效地检测这四种主要的猪病毒性腹泻病原体。该方法不仅适用于实验室研究，还具有在临床诊断和疾病监测中的广泛应用前景。随着对猪病毒性腹泻病原体研究的深入，这种高效、便捷的检测方法将为猪场的疾病防控提供重要支持，有助于提高诊断效率，减少经济损失，并推动相关领域的研究进展。