基于环境DNA的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法，用于水生环境中摇蚊幼虫的现场检测

《Pest Management Science》：Environmental DNA-based RPA-CRISPR/Cas12a assay for on-site detection of chironomid larvae in aquatic environments

水蛭幼虫通过eDNA结合RPA-CRISPR/Cas12a系统实现快速灵敏检测，LFA方法更适用于现场应用，有效提升饮用水安全和生态监测水平。

　　在现代社会，随着人类活动对自然环境的持续影响，淡水生态系统正面临越来越多的威胁。这些生态系统不仅在维持生物多样性方面具有重要作用，还承担着碳固存、水净化、营养循环等关键生态功能。然而，近年来，随着农业径流、城市扩张和工业排放带来的污染加剧，外来物种的入侵问题也日益严重，尤其是水生昆虫类群，它们在生态平衡中扮演着破坏者的角色。其中，非咬蝇（chironomid midges）因其幼虫侵入饮用水过滤系统和水处理设施而成为公众关注的焦点。这类昆虫的广泛分布不仅影响了饮用水的安全性，还对淡水生态系统的稳定性构成了潜在威胁。

在韩国，非咬蝇的侵扰现象已被多次记录，尤其是在淡水生态系统和饮用水处理设施中，其存在可能引发生物污染，进而对水质和公众健康产生负面影响。例如，2020年韩国仁川地区发生了一次非咬蝇幼虫大规模爆发事件，该事件迅速蔓延至全国，引发了数百起新的报告，凸显了非咬蝇对饮用水质量的潜在危害。传统的生物监测方法主要依赖于肉眼观察或显微镜检查，但这些方法通常只能检测到水体表层的昆虫，并且无法提供全面的评估。因此，开发一种更加敏感、快速且适用于现场检测的生物监测技术变得尤为迫切。

针对这一需求，研究人员开发了一种基于环境DNA（eDNA）分析的诊断方法，结合了重组酶介导的等温扩增（RPA）技术与CRISPR/Cas12a介导的切割反应，实现了对非咬蝇的高效检测。这种方法通过荧光检测或侧向流动试纸（LFA）进行可视化，具有较高的灵敏度和准确性。RPA技术能够在恒定温度下快速完成扩增过程，而CRISPR/Cas12a则提供了精确的靶向识别能力。此外，LFA方法因其操作简便、无需复杂设备、成本低廉等优点，特别适合用于现场应用。该技术不仅能够提高检测效率，还为饮用水安全和生态监测提供了新的可能性。

为了确保该方法的准确性，研究人员首先在实验室环境下对RPA引物和crRNA进行了筛选和优化。通过合成双链DNA片段（gBlocks）作为模板，评估了不同引物组合的扩增效率和特异性。结果显示，某些引物组合会产生非特异性扩增，因此需要进一步筛选，以确保只有目标物种的DNA能够被有效识别。最终，研究人员选择了两组引物，分别用于三种非咬蝇物种的检测。随后，他们通过荧光检测和LFA方法对这些引物组合进行了验证，发现两种方法在检测灵敏度方面表现相似，但LFA方法在实际应用中更具优势。

此外，研究人员还对crRNA的特异性进行了评估，发现其能够有效识别目标物种的DNA序列，并且在非目标物种中表现出较低的交叉反应性。这表明，该方法在实际应用中具有较高的特异性，能够减少误报的可能性。在实际应用中，研究人员采集了来自韩国五个不同地区的淡水样本，并通过优化的RPA-CRISPR/Cas12a方法进行检测。结果显示，该方法能够准确识别出非咬蝇的存在，并且在不同地区的样本中表现出一致的趋势。

为了进一步验证该方法的可靠性，研究人员将RPA-CRISPR/Cas12a的检测结果与显微镜观察的结果进行了比较。结果显示，尽管存在一些差异，但两种方法在大多数情况下表现出一致性。这表明，RPA-CRISPR/Cas12a方法能够有效地捕捉到非咬蝇的分子痕迹，即使这些昆虫并未直接出现在采样点。这与eDNA的特性相符，因为eDNA可以通过水文过程从上游或相邻区域迁移至采样点。此外，eDNA分析对污染和降解非常敏感，因此需要严格的样品保存和运输条件，以确保检测结果的准确性。

综上所述，该研究开发了一种基于eDNA的RPA-CRISPR/Cas12a方法，能够实现对非咬蝇的快速、灵敏和现场检测。该方法不仅克服了传统生物监测方法的局限性，还为饮用水安全和生态监测提供了新的工具。随着技术的不断进步，未来可能会出现更多便携式设备，使得RPA-CRISPR/Cas12a技术能够在实际应用中发挥更大的作用。这种技术的推广和应用，将有助于提高生物监测的效率，为环境保护和公众健康提供有力支持。