通过调控黄酮类芦丁糖生物合成途径，成功实现了番茄（Solanum lycopersicum）和烟草（Nicotiana tabacum）中具有血管活性化合物——地奥辛（Diosmin）的量产

《Plant Biotechnology Journal》：Engineering of the Flavone Rutinoside Biosynthetic Pathway Enables Production of Diosmin, a Venoactive Compound in Solanum lycopersicum and Nicotiana tabacum

异源生物合成O-甲基化黄酮二糖苷在番茄和烟草中成功实现，通过构建多基因表达载体并引入黄酮合成相关酶（FNSII、FOMT、GlcT2、RhaT），番茄果皮中Diosmin产量达474 ng/g DW，烟草叶片中Linarin达299.5 ng/g DW，isorhoifolin为2.8 ng/g DW。揭示了内源代谢流对产物的影响及基因协同表达机制。

　　这项研究围绕着一种名为地奥司明（diosmin）的天然植物化合物展开，地奥司明属于黄酮类物质，常用于治疗静脉疾病。地奥司明的合成通常依赖于从黄酮醇类物质如芦丁（rutin）中进行一系列化学修饰，包括甲基化和糖基化反应。然而，传统的地奥司明生产方法往往需要复杂的化学合成步骤，限制了其在生物工程中的应用。因此，研究人员试图通过基因工程技术，在植物中实现地奥司明及其类似物如林兰（linarin）和异鼠李素（isorhoifolin）的异源合成，以更高效、环保的方式获取这些具有潜在药用价值的化合物。

研究团队首先从菊科植物“金盏花”（*Chrysanthemum indicum*）中鉴定并表征了一种黄酮-O-甲基转移酶（F4′OMT）和两种糖基转移酶（F7GlcTs），并结合之前发现的黄酮合成酶（FNSII）和鼠李糖转移酶（RhaT），构建了完整的地奥司明生物合成途径。这一研究不仅填补了相关基因的空白，还为后续的植物代谢工程提供了重要的理论基础和技术手段。

为了实现这些基因在植物中的高效表达，研究者采用了一种基于同尾酶（isoschizomer）的基因堆叠策略，将FNSII、OMT、GlcT和RhaT依次插入到一个多基因表达载体中，并通过农杆菌（*Agrobacterium tumefaciens*）转化到番茄（*Solanum lycopersicum*）品种“MicroTom”和烟草（*Nicotiana tabacum*）中。结果显示，转基因番茄的果皮中地奥司明的含量达到了474?ng/g干重，而转基因烟草的叶片中地奥司明含量为20.5?ng/g干重。此外，林兰和异鼠李素也在转基因烟草中被检测到，分别为299.5?ng/g和2.8?ng/g。这些数据表明，通过基因工程手段，地奥司明及其类似物可以在非天然合成这些化合物的植物中被成功生产。

在实验过程中，研究团队对候选基因的催化活性进行了验证。通过克隆和表达*Chrysanthemum indicum*的cDNA，并将其与大肠杆菌（*E. coli*）表达载体结合，研究人员发现CiFOMT具有对黄酮类物质进行4′-甲基化的能力，而CiGlcT1和CiGlcT2则能对黄酮类物质进行糖基化反应。进一步的实验表明，CiGlcT1和CiGlcT2对不同底物的亲和力和催化效率各不相同，CiGlcT2在某些底物上表现出更高的催化效率，这可能与其在植物中的功能更为契合。同时，CiFOMT的催化特性通过体外酶活性实验得到了验证，显示其能够高效地将底物转化为甲基化产物。

在构建基因表达载体时，研究团队采用了一种基于同尾酶的灵活拼接策略，使得多个基因能够有序地整合到一个表达载体中，提高了基因工程的效率。这种策略的优势在于，它避免了传统基因克隆中对特定限制酶切位点的依赖，从而简化了多基因表达的构建过程。通过这种方式，研究团队成功地将FNSII、OMT、GlcT和RhaT整合到一个植物表达载体中，并用于转基因番茄和烟草的构建。

为了验证这些基因在植物中的表达和功能，研究者进行了转录组分析和RT-qPCR实验。结果显示，CiFOMT和CiGlcT2在花和花芽中具有较高的表达水平，而CiGlcT1在这些组织中的表达则较低。这一发现进一步支持了这些基因在植物中可能的亚细胞定位，以及它们在代谢途径中的角色。通过荧光显微镜的观察，研究团队确认了这些基因主要定位于细胞质中，这表明在植物中，黄酮类物质的合成主要依赖于细胞质中的酶催化过程。

在实际的代谢产物分析中，研究者使用了高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS/MS）对转基因番茄和烟草中的代谢产物进行了检测。结果显示，转基因番茄的果皮中成功积累了地奥司明，而转基因烟草的叶片中不仅积累了地奥司明，还检测到了林兰和异鼠李素。这一结果表明，这些基因的引入不仅改变了植物的代谢路径，还成功地生成了多种结构相似的黄酮类化合物。此外，研究团队还分析了这些化合物的代谢产物在植物中的积累情况，发现地奥司明的产量较高，而林兰和异鼠李素的产量相对较低，这可能与某些代谢瓶颈有关。

研究团队还探讨了内源酶和代谢通量对特定化合物生成的影响。例如，CiFOMT和CiGlcT2在体外实验中表现出较高的催化效率，但在植物中的表达可能受到内源酶的竞争和代谢通量的限制。因此，研究者提出，未来在提高这些化合物产量方面，应注重提升前体供应、抑制竞争性代谢途径，并优化异源酶的表达和协调。通过这些策略，有望实现更高效的黄酮类化合物合成。

此外，研究团队还注意到，最初的载体设计中，由于使用了NcoI限制酶切位点，可能引入了一个上游的ATG密码子，从而形成一个翻译抑制的上游开放阅读框（uORF）。这一问题在瞬时表达实验中得到了验证，表明去除uORF可以略微提高产物的产量，说明当前的转基因策略在翻译效率上仍存在一定的优化空间。不过，尽管存在这一问题，转基因植物仍能够成功合成目标化合物，说明基因表达水平已经足够支撑整个代谢途径的完成。

总体来看，这项研究不仅揭示了地奥司明及其类似物的生物合成路径，还为植物代谢工程提供了新的方法和技术。通过基因工程手段，研究人员成功地在番茄和烟草中实现了这些具有潜在药用价值的化合物的合成，这为未来在农业和医药领域应用提供了重要的参考。同时，研究还指出了在异源合成过程中可能遇到的挑战，如代谢瓶颈、内源酶的竞争以及表达效率的问题，为后续研究提供了方向。