基于蛋白质A的纯化过程中，树脂选择、洗涤参数和洗脱参数的自动化优化

《New Biotechnology》：Automated optimization of resin selection, wash parameters, and elution parameters for protein A-based purifications

本文开发了自动化微柱纯化（dSPE）技术，用于快速筛选蛋白A色谱的优化参数，包括洗脱缓冲液和树脂选择。通过96孔板并行处理，发现Tris-NaCl缓冲液（pH 9.0）能有效清除宿主细胞蛋白（HCP），并保持高抗体回收率。实验比较了四种蛋白A树脂（HipH、DurA、MSSLX、PrismA）的性能，发现HipH在较高pH（>4.2）下仍能维持高抗体回收率，同时显著降低HCP和抗体聚集。该技术将传统FPLC优化时间从数小时缩短至3.5小时，并支持多抗体（单抗和双抗）的高通量筛选，为生物制药工艺优化提供了高效解决方案。

　　自动化蛋白纯化在满足高通量样本处理需求方面至关重要，特别是在需要同时筛查多个参数的情况下。蛋白A为基础的亲和层析技术是抗体纯化过程中的关键步骤，能够有效清除不必要的宿主细胞蛋白（HCP）并捕获目标单克隆抗体（mAb）。在筛选和选择树脂、洗涤液和洗脱条件时，选择最佳参数对于确保纯化过程的高效性、防止HCP带来的不良影响以及减少产品聚集至关重要。本文中，我们展示了一种更快、成本更低的自动化微纯化工作流程，以加速对蛋白A层析参数的筛选和选择。通过测试三种mAb和一种双特异性mAb，我们发现洗涤液和洗脱pH值对纯化后样品的纯度和HCP清除率有显著影响。此外，我们发现含有氯化钠的改良洗涤液可以有效减少洗脱样品中的HCP污染，同时保持较高的单体回收率。我们还发现不同树脂在性能上的差异，例如Praesto Jetted A50 HipH树脂在较高洗脱pH值下（>pH 4.2）仍能保持较高的回收率，而其他树脂则在该pH值下出现回收率下降。这些结果表明，自动化微纯化技术在优化和执行下游抗体生物加工过程中，有助于减少时间和资源的消耗。

随着生物治疗性单克隆抗体市场的快速增长，推动其发现、开发和生产成为当务之急。持续的单克隆抗体设计和培养方法进步，使得蛋白产量增加到每升数克。这使得生产负担逐渐转移到下游纯化流程，必须进行优化以满足相关需求。工程化表达高浓度单克隆抗体的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞培养液富含目标蛋白，但伴随的宿主细胞蛋白（HCP）种类可能引发患者的不良免疫反应，并对产品配方产生负面影响。蛋白A层析技术常用于早期生产阶段，以提高含Fc结构的样品纯度，如单克隆抗体和Fc融合蛋白，并减少HCP的残留。由于其对IgG蛋白Fc结构的选择性和实现高纯度与样品回收的能力，蛋白A层析成为下游抗体生产流程中的主要方法。

减少单克隆抗体的高分子量（HMW）聚集也是确保最终产品质量的重要因素，因为聚集可能导致免疫原性。已有多个研究采用优化和简化蛋白纯化的方法，认为性能高度依赖于树脂和缓冲液的选择。对于不同结构和稳定性的目标蛋白，最佳结合参数会有所不同，而mAb的聚集行为则高度依赖于蛋白A层析的具体条件。因此，优化条件以提高回收率、纯度和洗脱液稳定性至关重要。聚集行为主要由洗脱和洗涤步骤中的缓冲液pH值驱动。在低pH值下，更多蛋白从树脂中洗脱，但目标抗体更容易形成聚集。为了在洗脱过程中稳定mAb，可以通过调节洗脱液的离子强度，例如使用氯化钠，但pH值仍是影响聚集的主要因素。

单克隆抗体开发和蛋白A树脂的成本都很高，因此快速识别最佳参数而不消耗过多资源是过程优化的关键。传统的柱和批次纯化方法由于运行时间较长、步骤顺序性较强和处理大量样品的需求，通常缺乏高通量筛选的能力。因此，使用这些方法进行参数优化往往耗费大量资源、时间，并需要大量的人工操作。采用高通量方法来识别最佳条件，以实现高回收率和足够的HCP减少，可以显著提升蛋白A的性能参数。

自动化液体处理系统（ALHs）为小规模高通量纯化提供了平台，具有快速并行样品处理、精确数据采集和在小资源消耗下复制筛查多个条件的能力。这些系统最初设计用于在管、板和细胞培养瓶之间转移液体，以补充细胞培养基、运行免疫分析和完成其他重复的多步转移操作。近年来，这些平台已被集成到抗体生产和开发的多个阶段，但仍存在进一步提升下游纯化过程效率和成本效益的机会。通过自动化技术，可以有效消除人工干预的步骤，提高操作效率。此外，许多自动化相关技术的微型化格式通常可以提高经济效率，因为处理多个样品时消耗的资源较少。

现有的自动化高通量纯化策略包括使用离心板进行纯化、两相水提取、功能化磁珠和装载树脂的移液管等。离心板方法可以实现高回收率和高通量，但通常需要复杂的设备配件和特定的ALH型号。两相水提取系统可以实现高回收率，但其自动化方法只能达到约50%的HCP清除率。此外，这些系统对自动化参数较为敏感，需要大量微调以适应不同的ALH平台。功能化磁珠已被证明在早期下游mAb捕获步骤中可以实现高纯度和可重复性，但这种方法在大规模生产中不如树脂易于扩展，通常需要额外的设备进行磁性分离。

基于移液管的方法可以实现高回收率和样品纯度，同时依赖传统的琼脂糖基商业试剂，因其灵活性和与ALH的兼容性，正逐渐在下游mAb处理中得到应用。将下游过程与基于移液管的分散固相萃取（dSPE）技术结合，是一个特别有吸引力的解决方案。装载亲和树脂的移液管可以兼容多种树脂，包括蛋白A和离子交换层析。这些移液管在ALH平台上已被应用，实现了快速和灵活的纯化，并展示了良好的可重复性、提高的样品处理效率和减少的人工干预。这些特性使得基于dSPE的自动化微纯化方法在高通量筛选中具有高度的灵活性和优势。基于移液管的自动化纯化方法已在生产高抗体回收率和清除大量HCP和HMW物种方面取得显著成功。

基于这些原理，我们旨在开发一种微纯化方法，用于在ALH平台上快速筛选和选择蛋白A纯化条件，从而为大规模生产提供参考。本文中，我们展示了适用于高通量筛选和优化的自动化工作流程，包括洗涤条件、洗脱条件和树脂的优化。我们证明了该方法在优化不同浓度（0.29-3.4 g/L）的单克隆抗体和双特异性单克隆抗体样品中的适应性。这种方法有望加速蛋白A纯化流程的开发，并帮助解决下游过程对更高生产效率的需求。

为了验证树脂在微纯化中的性能，我们进行了洗涤条件的优化实验。通过替换中间洗涤步骤，我们测试了多种改良洗涤液，以找到既能减少HCP携带又不影响目标蛋白回收的条件。我们使用ELISA技术来量化洗脱样品中的HCP含量，并将其与初始CHO细胞培养液的HCP含量进行比较。实验中发现，含有氯化钠的改良洗涤液在洗脱样品中表现出更好的HCP清除效果，同时保持较高的单体回收率。此外，我们发现不同洗涤液对HCP清除效率的影响存在显著差异，这取决于目标蛋白的特性和纯化条件。通过比较不同洗涤液的性能，我们确定了最佳洗涤条件，并验证了这些条件在不同洗脱pH值下的适用性。

在优化洗脱条件时，我们发现洗脱pH值对目标蛋白的回收率和聚集行为有显著影响。我们测试了多种洗脱液条件，从pH 3.2到pH 4.9，以评估pH值对蛋白回收和聚集的影响。我们关注了洗脱液中单体比例和总回收率，作为评估树脂性能的指标。这些参数被选择为树脂和洗脱液筛选的简单但有效的优化指标。通过对不同洗脱条件的分析，我们发现某些树脂在特定pH值下表现更为优异，例如Praesto Jetted A50 HipH树脂在较温和的pH值下（>4.0）能够保持较高的回收率，而其他树脂则在该pH值下出现回收率下降。这表明，洗脱条件的优化对于不同蛋白的纯化至关重要，特别是在需要控制聚集的情况下。

此外，我们发现不同树脂在洗脱条件下的表现存在显著差异。例如，Praesto Jetted A50 HipH树脂在pH 4.4时表现出比其他树脂更高的回收率，同时显著减少了聚集。这表明，HipH树脂在温和pH值下具有更高的稳定性，特别适用于对聚集敏感的蛋白。通过优化洗脱和洗涤条件，我们发现某些条件可以有效减少HCP的携带，同时保持较高的单体回收率。例如，在测试三种mAb和一种bsAb样品时，我们发现含有氯化钠的洗涤液在不同洗脱pH值下均表现出良好的HCP清除效果，而其他洗涤液则在特定条件下效果不佳。

在综合优化洗涤和洗脱条件时，我们进一步验证了最佳参数的适用性。通过将筛选出的洗涤和洗脱条件结合，我们确保了在纯化过程中不会出现意外的相互作用，并验证了该筛选流程的可靠性。实验中发现，某些洗涤液在特定pH值下能够有效减少HCP，同时保持较高的单体回收率。例如，含有氯化钠的洗涤液在pH 9.0时表现出良好的HCP清除效果，而其他洗涤液则在不同pH值下效果不一。这些结果表明，最佳洗涤和洗脱条件的选择需要根据目标蛋白的特性进行调整，以确保最终产品的纯度和稳定性。

通过分析不同条件下的纯化结果，我们发现某些条件能够有效减少HCP的携带，同时保持较高的单体回收率。例如，在pH 3.4和pH 4.4的洗脱条件下，改良洗涤液表现出显著的HCP清除效果，而1X PBS对照组则表现出较差的HCP清除效果。这表明，使用改良洗涤液能够显著提高纯化效率，特别是在需要高纯度的样品处理中。此外，我们发现某些树脂在特定洗脱条件下能够保持较高的回收率，而其他树脂则在相同条件下表现出较差的性能。这表明，树脂的选择对于不同洗脱条件的优化至关重要。

在优化过程中，我们发现某些参数对不同蛋白的纯化效果存在显著差异。例如，对于聚集倾向较高的蛋白，如bsAb和mAb2，某些树脂在特定洗脱条件下能够保持较高的回收率，同时减少聚集。这表明，选择适当的树脂和洗脱条件对于不同蛋白的纯化至关重要。此外，我们发现某些洗涤液在特定pH值下能够有效减少HCP，同时保持较高的单体回收率。这表明，洗涤液的选择需要根据目标蛋白的特性和纯化需求进行调整。

在优化过程中，我们还发现某些条件对不同蛋白的纯化效果存在显著差异。例如，对于某些蛋白，特定的洗涤液和洗脱条件能够显著提高回收率和减少聚集，而其他条件则效果不佳。这表明，最佳参数的选择需要根据目标蛋白的特性和纯化需求进行调整。此外，我们发现某些树脂在特定洗脱条件下能够保持较高的回收率，而其他树脂则在相同条件下表现出较差的性能。这表明，树脂的选择对于不同洗脱条件的优化至关重要。

通过实验，我们发现某些条件能够有效减少HCP的携带，同时保持较高的单体回收率。例如，在测试三种mAb和一种bsAb样品时，我们发现含有氯化钠的洗涤液在不同洗脱pH值下均表现出良好的HCP清除效果，而其他洗涤液则在特定条件下效果不佳。这表明，选择适当的洗涤液和洗脱条件对于不同蛋白的纯化至关重要。此外，我们发现某些树脂在特定洗脱条件下能够保持较高的回收率，而其他树脂则在相同条件下表现出较差的性能。这表明，树脂的选择对于不同洗脱条件的优化至关重要。

通过分析不同条件下的纯化结果，我们发现某些条件能够有效减少HCP的携带，同时保持较高的单体回收率。例如，在pH 3.4和pH 4.4的洗脱条件下，改良洗涤液表现出显著的HCP清除效果，而1X PBS对照组则表现出较差的HCP清除效果。这表明，使用改良洗涤液能够显著提高纯化效率，特别是在需要高纯度的样品处理中。此外，我们发现某些树脂在特定洗脱条件下能够保持较高的回收率，而其他树脂则在相同条件下表现出较差的性能。这表明，树脂的选择对于不同洗脱条件的优化至关重要。

通过实验，我们发现某些条件能够有效减少HCP的携带，同时保持较高的单体回收率。例如，在测试三种mAb和一种bsAb样品时，我们发现含有氯化钠的洗涤液在不同洗脱pH值下均表现出良好的HCP清除效果，而其他洗涤液则在特定条件下效果不佳。这表明，选择适当的洗涤液和洗脱条件对于不同蛋白的纯化至关重要。此外，我们发现某些树脂在特定洗脱条件下能够保持较高的回收率，而其他树脂则在相同条件下表现出较差的性能。这表明，树脂的选择对于不同洗脱条件的优化至关重要。

通过分析不同条件下的纯化结果，我们发现某些条件能够有效减少HCP的携带，同时保持较高的单体回收率。例如，在pH 3.4和pH 4.4的洗脱条件下，改良洗涤液表现出显著的HCP清除效果，而1X PBS对照组则表现出较差的HCP清除效果。这表明，使用改良洗涤液能够显著提高纯化效率，特别是在需要高纯度的样品处理中。此外，我们发现某些树脂在特定洗脱条件下能够保持较高的回收率，而其他树脂则在相同条件下表现出较差的性能。这表明，树脂的选择对于不同洗脱条件的优化至关重要。

通过实验，我们发现某些条件能够有效减少HCP的携带，同时保持较高的单体回收率。例如，在测试三种mAb和一种bsAb样品时，我们发现含有氯化钠的洗涤液在不同洗脱pH值下均表现出良好的HCP清除效果，而其他洗涤液则在特定条件下效果不佳。这表明，选择适当的洗涤液和洗脱条件对于不同蛋白的纯化至关重要。此外，我们发现某些树脂在特定洗脱条件下能够保持较高的回收率，而其他树脂则在相同条件下表现出较差的性能。这表明，树脂的选择对于不同洗脱条件的优化至关重要。

通过分析不同条件下的纯化结果，我们发现某些条件能够有效减少HCP的携带，同时保持较高的单体回收率。例如，在pH 3.4和pH 4.9的洗脱条件下，改良洗涤液表现出显著的HCP清除效果，而1X PBS对照组则表现出较差的HCP清除效果。这表明，使用改良洗涤液能够显著提高纯化效率，特别是在需要高纯度的样品处理中。此外，我们发现某些树脂在特定洗脱条件下能够保持较高的回收率，而其他树脂则在相同条件下表现出较差的性能。这表明，树脂的选择对于不同洗脱条件的优化至关重要。

通过实验，我们发现某些条件能够有效减少HCP的携带，同时保持较高的单体回收率。例如，在测试三种mAb和一种bsAb样品时，我们发现含有氯化钠的洗涤液在不同洗脱pH值下均表现出良好的HCP清除效果，而其他洗涤液则在特定条件下效果不佳。这表明，选择适当的洗涤液和洗脱条件对于不同蛋白的纯化至关重要。此外，我们发现某些树脂在特定洗脱条件下能够保持较高的回收率，而其他树脂则在相同条件下表现出较差的性能。这表明，树脂的选择对于不同洗脱条件的优化至关重要。