用于选择性检测硝基还原酶和乳腺癌肿瘤成像的近红外荧光探针

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Near-infrared fluorescent probe for selective detection of nitroreductase and tumor imaging in breast cancer

本研究开发新型近红外荧光探针FQ-NO2，可有效检测乳腺癌中硝基还原酶（NTR）活性，具有高灵敏度（检测限0.7 ng/mL）、优异稳定性及体内成像潜力，为肿瘤缺氧相关酶检测及诊断治疗监测提供新工具。

　　

辛长|小雨婉|袁宇吴|彭毅马|英格

吉林大学第二医院乳腺外科，长春，130041，中国

摘要

硝基还原酶（NTR）是一种对氧气敏感的黄素蛋白，在肿瘤缺氧过程中起着关键作用，已被广泛认为是癌症诊断和治疗评估的潜在生物标志物。本文报道了一种新型近红外（NIR）荧光探针FQ-NO₂的开发，该探针能够灵敏且选择性地检测乳腺癌中的NTR活性。该探针具有“关闭-开启”响应特性：在缺乏NTR的情况下不发光，但在硝基被酶还原后，经过600 nm激发会在710 nm处发出强荧光。由于具有NIR发射特性，FQ-NO₂探针具有深层组织穿透能力，并产生低背景信号，因此适用于体内成像。该探针具有低检测限、高选择性和在生理条件下的优异稳定性。细胞研究表明，FQ-NO₂能够区分乳腺癌细胞和正常上皮细胞，并显示NTR活性的变化。体内荧光成像进一步证明，该探针在局部或全身给药后能够迅速激活，其信号与NTR活性相关。总体而言，这些结果表明FQ-NO₂是一种有前景的分子探针，可用于检测与肿瘤缺氧相关的酶和乳腺癌成像，在癌症诊断和治疗监测中具有潜在应用价值。

引言

硝基还原酶（NTR）是一种对氧气敏感的黄素蛋白，利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH或NADPH）作为辅因子催化硝基芳香族化合物的还原[1]。它在缺氧的肿瘤微环境中过度表达，并在快速增殖的实体瘤中普遍存在，包括乳腺癌[2,3]。缺氧不仅促进肿瘤进展、血管生成和转移，还会诱导对化疗和放疗等传统疗法的耐药性[4,5]。因此，NTR被认为是评估肿瘤缺氧的有效靶点，也是癌症诊断和预后的重要生物标志物。

已经开发了几种NTR检测方法，包括分光光度法[6]、[7]、[8]、电化学检测[9,10]、表面增强拉曼光谱[11,12]和质谱法[13]。尽管这些方法提供了有用的信息，但它们通常受到灵敏度低、操作繁琐以及无法实时监测复杂生物系统的限制。相比之下，荧光探针具有高灵敏度、实时响应性和非侵入性成像能力[14]、[15]、[16]、[17]等独特优势。在近红外（NIR）区域（650–900 nm）发射的探针特别适用于体内应用，因为它们具有更好的组织穿透性和最小的背景荧光[18]、[19]、[20]、[21]、[22]。近年来报道了多种响应NTR的荧光探针[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]、[34]、[35]、[36]、[37]、[38]。这些探针通常使用硝基芳香族基团作为识别单元，这些基团可以被还原为胺[39]。然而，许多探针存在发射波长不足、光稳定性低或肿瘤靶向能力有限等缺点，限制了它们的临床应用。

为了解决这些限制，我们设计并合成了一种新型NIR荧光探针FQ-NO₂，用于选择性检测乳腺癌中的NTR。该探针在天然状态下不发光，但在NTR的作用下硝基被酶还原并在600 nm激发时，会发生结构转变，从而在710 nm处发出强荧光。这种开关机制提高了信噪比，使得在生理条件下能够进行灵敏检测。我们系统评估了FQ-NO₂的光物理性质、选择性和灵敏度，以及其在乳腺癌细胞和动物模型中的表现。结果表明，FQ-NO₂能够有效监测与肿瘤相关的缺氧情况，并提供适合实时成像的高对比度荧光信号。因此，这种探针可以成为癌症诊断和治疗评估的有力工具。

部分摘录

FQ-NO₂的合成

FQ-NO₂的合成路线如图1所示。

化合物1和化合物2根据先前报道的方案进行合成，并进行了轻微修改[40]。简要来说，化合物1（300 mg，1.0 mmol）和化合物2（217 mg，1.0 mmol）溶解在无水乙醇（20 mL）中。在搅拌过程中，逐滴加入哌啶（15 μL），然后将混合物在80°C下回流16小时。冷却至室温后，在减压条件下去除溶剂。

FQ-NO₂的光谱性质和传感机制

使用吸收光谱和荧光光谱系统评估了FQ-NO₂的光学性质（图2A）。在PBS缓冲液（pH 7.4）中，该探针在约590 nm处显示出弱吸收带，荧光几乎可以忽略不计（绝对量子产率= 0.01）。这表明硝基取代结构能够通过电子吸引效应有效淬灭荧光团。与NTR（10 μg/mL）和NADH（100 μM；辅因子）孵育后，在600 nm处出现一个新的吸收峰。

结论

在这项研究中，我们开发了FQ-NO₂，一种用于选择性检测NTR和乳腺癌成像的近红外荧光探针。该探针在完整状态下不发光。在NADH存在下，NTR对硝基进行酶还原并在600 nm激发时，会发生结构转变，从而在710 nm处发出强荧光。结果表明，FQ-NO₂具有高灵敏度（LOD = 0.7 ng/mL）、选择性和在生理条件下的光稳定性。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。