《The ISME Journal》：Phenylpropanoid methyl esterase unlocks catabolism of aromatic biological nitrification inhibitors
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为破解“植物释放的BNI在土壤中究竟能撑多久”这一瓶颈，作者整合转录组与RB-TnSeq全局突变体竞争实验，首次鉴定Pme（苯丙烷甲酯酶）与Pcd（phloretoyl-CoA脱氢酶）两条关键步骤，实现PPME（苯丙烷甲酯）完全矿化。该工作填补BNI降解路径空白，为合成生物学生产BNI作物提供可预测的微生物降解分子标记。
在农田里撒下的氮肥，约有一半会在微生物“助攻”下化作NO溜进大气，其温室效应是CO的300倍。植物并非坐以待毙——高粱、玉米等根系会分泌一类被统称为生物硝化抑制剂（BNI）的化学物质，把氨氧化菌（AOA/AOB）的“胃口”暂时关掉。然而BNI的田间效果飘忽不定，原因归结于一条黑箱：土壤微生物能否快速拆掉这些“分子护栏”？黑箱不打开，BNI增效减排就只能靠运气。
为回答“谁会把BNI吃光、怎么吃”这一关键问题，美国太平洋西北国家实验室Joshua Elmore团队以苯丙烷甲酯（PPME）——一类已被证实具BNI活性的芳香酸甲酯——为突破口，在《The ISME Journal》发表最新研究。作者首先筛选到一株能“啃”所有测试PPME（含MHPP、甲基-对香豆酸、甲基阿魏酸）的环境假单胞菌Pseudomonas fluorescens SBW25；继而联合转录组与随机条形码转座子测序（RB-TnSeq），锁定两条全新酶反应：由Pme（PFLU3311，丝氨酸水解酶超家族）切除甲酯生成相应芳香酸，再由Pcd（PFLU3296，酰基-CoA脱氢酶）氧化饱和侧链，最终把产物送入已知的对香豆酸降解通路。将pme与pcd异源转入原本无法利用PPME的P. putida KT2440、P. frederiksbergensis TBS10等根际优势菌后，工程株可在以MHPP为唯一碳源的最小培养基中稳健生长，证明该模块可通过水平基因转移快速扩散。研究首次给出BNI降解的完整基因-酶-通路证据链，为今后用宏基因组标记物预测BNI持久性、指导BNI作物设计奠定分子基础。
关键技术方法：
环境假单胞菌分离培养与表型筛选；RB-TnSeq全局突变体竞争适应度测定；RNA-seq差异表达；体外重组蛋白表达与LC-MS酶活验证；Bxb1整合酶介导的异源基因植入。
研究结果：
环境菌株可利用PPME作为唯一碳源
通过48孔板生长曲线比较，发现仅P. fluorescens SBW25能在MHPP、甲基-对香豆酸、甲基阿魏酸及潜在中间代谢物phloretate上生长，而P. putida KT2440等仅能利用phloretate，提示PPME利用能力在假单胞菌属内呈离散分布。
RB-TnSeq揭示MHPP适应度基因谱
构建SBW25随机条码突变库，在MHPP条件下检测到271个负适应度基因（<-1.8），远多于葡萄糖（82个）。其中ech基因簇（PFLU3296-PFLU3300）与邻近新簇（PFLU3304-PFLU3311）显著富集，暗示存在未知上游步骤。
转录组与适应度交叉锁定16个核心基因
RNA-seq显示43个基因在MHPP中上调≥8倍；与RB-TnSeq交集后聚焦16个基因，其中PFLU3311（pme）与PFLU3296（pcd）仅在含甲酯或饱和侧链底物中表现强烈适应度缺陷，被预测为PPME专属步骤。
Pme生化验证——新型苯丙烷甲酯酶
纯化重组Pme可在1 h内完全水解MHPP、甲基-对香豆酸、甲基阿魏酸生成对应芳香酸；LC-MS未检测到部分水解中间产物，证实其甲酯酶活性。
Pcd功能验证——phloretoyl-CoA脱氢酶
ΔPFLU3296株失去在MHPP与phloretate上生长能力，异位表达pcd可互补；体外CoA连接-脱氢反应提示其把phloretoyl-CoA氧化为对香豆酰-CoA，接入已知β-氧化通路。
异源移植实现PPME跨菌利用
将pme与pcd分别或组合插入缺乏该模块的P. putida KT2440、P. sp. TBS28及内生菌P. frederiksbergensis TBS10染色体，工程菌均获得MHPP生长表型，说明两基因足以赋予PPME降解能力。
结论与讨论：
研究首次描绘“Pme去甲基化→芳香酸活化→Pcd氧化侧链→汇入对香豆酸通路”的PPME完全降解路线，并验证其模块化可移植性。该发现把BNI降解从“黑箱”提升到“可预测”层面：pme与pcd的 presence/absence 可作为分子标记，直接指示土壤微生物组对特定BNI的潜在清除速率；合成生物学工作者可在设计BNI作物或微生物菌剂前，先评估目标农田的pme/pcd丰度，从而优化施用量与频次。更广义地看，Pme代表一类尚未被注释的甲基酯酶家族，其底物谱可能延伸至木质素-碳水化合物复合物中其他甲酯键，为碳循环与农业减排交叉领域提供新工具。
