自然感染放牧牛粪便中分离存活牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）的实证研究及其传播意义

《Journal of Applied Microbiology》：Isolation of viable Mycobacterium bovis from faeces of naturally infected free-ranging rural domestic cattle (Bos taurus)

本研究针对牛结核病（bTB）环境传播路径不清的问题，研究人员通过BSL-3实验室条件下对79份南非放牧牛粪便样本进行分枝杆菌培养与GeneXpert? MTB/RIF Ultra（GXU?）检测，首次从自然感染牛粪便中成功分离出存活M. bovis（SB0130型），证实了粪便排菌作为潜在传播途径的重要性，为完善bTB防控策略提供了关键现场证据。

　　

在广袤的非洲草原上，牛群与野生动物共享着水源和牧场，这种亲密无间的共存模式却暗藏健康危机。牛结核病（bovine tuberculosis, bTB）作为一种由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起的人兽共患病，在撒哈拉以南非洲地区持续流行，不仅造成畜牧业经济损失，更对公共卫生构成威胁。传统观点认为，bTB主要通过呼吸道传播，控制措施因此聚焦于肺部病变检测。然而，越来越多的证据表明，患病的牛只可能通过粪便排出病原体，污染土壤、水源和饲料，形成潜在的环境传播链。尽管这一途径在实验条件下已被观察到，但在自然放牧的真实场景中，牛分枝杆菌是否真的能通过粪便存活并传播，始终缺乏直接的现场证据。

为了解开这一谜团，由南非医学研究委员会结核病研究中心的Rachiel Gumbo领衔的研究团队，深入南非夸祖鲁-纳塔尔省的农村地区，对自由放牧的肉牛群展开了调查。该地区以其牛结核病在牲畜与野生动物（如非洲水牛）中的地方性流行而闻名，且缺乏系统的结核病监测项目，是研究该病传播生态学的理想场所。研究人员在《Journal of Applied Microbiology》上发表的研究，首次提供了在自然感染条件下，从放牧家牛粪便中分离出存活牛分枝杆菌的坚实证据。

为了完成这项研究，研究人员主要运用了几项关键技术。他们从79头自由放牧的农村家牛（主要为恩古尼杂交种）直肠采集粪便样本，所有样本处理均在生物安全三级（BSL-3）实验室条件下进行。研究核心采用了分枝杆菌培养这一“金标准”方法，使用BACTEC? MGIT? 960系统进行液体培养，并对阳性培养物进行固体培养基亚培养和抗酸染色（Ziehl-Neelsen staining）。同时，他们利用GeneXpert? MTB/RIF Ultra（GXU?）这一快速分子检测技术直接检测粪便悬液中的结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC）DNA。最后，对培养获得的分离株，通过基因区段缺失（Region of Difference, RD）PCR和间隔区寡核苷酸分型（spoligotyping）进行菌种鉴定和基因分型，并对非结核分枝杆菌（Nontuberculous mycobacteria, NTM）通过hsp65基因测序进行鉴定。

研究结果

样本收集与总体培养结果

研究共收集了79头牛的粪便样本，这些牛来自7个公共浸浴池和1个农场。样本经过处理后，接种到MGIT?培养管中。结果显示，87.3%（69/79）的初级MGIT?管在培养系统中呈阳性信号。将这些阳性培养物进一步接种到固体培养基上后，59.4%（41/69）出现了细菌菌落生长。经过抗酸染色鉴定，其中12.2%（5/41）的分离株为抗酸杆菌阳性。

牛分枝杆菌的分离与确认

在5株抗酸杆菌阳性的分离株中，通过RD-PCR成功确认其中2株（占阳性分离株的40%）为牛分枝杆菌（M. bovis）。这两株菌（编号WG31和WG34）均来自同一个农场（F1）的牛只，一为成年母牛，一为亚成年母牛。进一步的基因分型显示，两者均为SB0130基因型，提示它们可能来源于共同的感染源或存在局部传播。

GeneXpert? MTB/RIF Ultra (GXU?) 检测结果

GXU?检测结果显示，10.1%（8/79）的粪便样本中检测到MTBC DNA，包括Trace（微量，n=4）、低（n=1）和高（n=3）等不同等级。值得注意的是，培养出存活M. bovis的那两份样本，其GXU?检测结果也呈阳性（分别为低和高浓度），这支持了GXU?作为快速筛查工具的效用。然而，在另外6份GXU?阳性但培养阴性的样本中，未能分离出存活的MTBC，这可能意味着细菌已死亡、载量过低或在去污染过程中被灭活。

非结核分枝杆菌（NTM）的发现

研究还从粪便中分离出了多种非结核分枝杆菌，包括鸟分枝杆菌复合群（Mycobacterium avium complex, 从WG25分离）和海滨分枝杆菌（Mycobacterium litorale, 从WG64分离）。此外，从一份GXU? Trace阳性的样本（WG20）中分离出了一株未能精确鉴定到种的分枝杆菌（Mycobacterium species）。这些NTM的共存凸显了在bTB流行区进行鉴别诊断的复杂性，因为NTM可能干扰基于免疫学的检测方法（如结核菌素皮试），并可能在分子或培养检测中造成假象。

流行病学关联分析

虽然样本量有限，但数据分析显示，雄性牛只中GXU?检测阳性比例（21%）高于雌性（8%），但无统计学显著性。成年牛与亚成年牛的阳性率相近（10% vs 12%）。在空间分布上，浸浴池D1检测到的MTBC DNA阳性动物数量最多（n=4），且其中三头为雄性，但这些个体的培养结果均为阴性。

研究结论与意义

这项研究得出的核心结论是：在自然感染条件下，自由放牧的家牛确实可以通过粪便排出存活的牛分枝杆菌（M. bovis）。这一发现挑战了牛结核病 solely（仅仅）通过呼吸道传播的传统认知，强调了胃肠道途径和环境污染物在疾病传播动力学中可能扮演着重要角色。研究所在地——夸祖鲁-纳塔尔省——已知存在牲畜与野生动物间的bTB传播，因此粪便排菌可能加剧环境中的病原体负荷，特别是在共享牧场和水源的 communal grazing systems（公共放牧系统）中，构成了间接传播的风险。

GXU? assay（检测）在本研究中被证明能够快速检测牛粪便中的MTBC DNA，与培养结果有部分一致性，显示了其作为现场筛查工具的潜力。然而，其局限性也不容忽视：它无法区分存活的与非存活的细菌，也不能鉴别MTBC内的不同成员（如M. bovis与M. tuberculosis）。因此，它更适合作为初筛手段，仍需培养等方法进行确认。

多种非结核分枝杆菌（NTM）的分离，反映了牛群广泛的环境暴露。这些NTM的存在不仅对bTB的诊断构成挑战，其本身也可能对动物健康产生影响，并且部分NTM（如鸟分枝杆菌复合群）也具备 zoonotic potential（人兽共患潜力）。这凸显了在“One Health”（一体化健康）框架下，统筹考虑动物、人类和环境健康的重要性。

综上所述，本研究提供了令人信服的 field-based evidence（现场证据），证明粪便排菌是牛结核病流行病学中一个此前被低估的环节。研究结果强烈建议，在bTB的高发地区，特别是存在野生动物-家畜界面的区域， surveillance and control programs（监测与控制项目）需要将环境样本（如粪便、水、土壤）的检测纳入考量，并采用培养与分子诊断相结合的综合策略，以更准确地评估传播风险和制定有效的干预措施。这对于保障畜牧业可持续发展、保护野生动物和维护公共健康安全均具有深远的意义。