革兰氏阳性接合元件中两个OB折叠蛋白在松弛体组装和DNA加工中的关键作用揭示新型接合机制

《Nucleic Acids Research》：Two OB-fold proteins from a Gram-positive conjugative element engage in relaxosome assembly and DNA processing

本研究针对革兰氏阳性菌中广泛存在的ICESt3/Tn916/ICEBs1超家族接合元件的DNA加工机制展开探索。研究人员发现该元件编码的两个OB折叠蛋白OrfL和OrfM能与MOBT松弛酶RelSt3形成复合物，通过细菌双杂交、ITC和SEC-MALS等技术证实二者形成1:1异源二聚体，且通过NMR解析了OrfM的非典型OB折叠结构。实验表明OrfL作为分子桥梁同时与RelSt3和PcrA解旋酶互作，显著刺激松弛酶切割活性而抑制链转移活性，阐明了一种区别于传统RHH蛋白的新型松弛体组装模式。

　　

在微生物世界中，细菌基因组的演化很大程度上依赖于水平基因转移，而接合作用作为其中重要机制，通过可移动遗传元件（如整合性接合元件ICE）传播抗生素耐药基因等适应性特征。ICESt3/Tn916/ICEBs1超家族在革兰氏阳性菌中分布广泛，其编码的非典型MOB_T家族松弛酶与已知的HUH内切酶家族松弛酶截然不同。尽管前期研究揭示了ICESt3编码的RelSt3松弛酶能够识别远距离结合位点并催化DNA切割，但该元件的接合转移机制仍存在大量未知，特别是其松弛体组装过程中辅助蛋白的作用机制亟待阐明。

为系统解析ICESt3的接合机制，研究团队综合运用基因敲除技术构建了orfL和orfM缺失突变株，通过接合实验验证其必要性；利用SEC-MALS、ITC和细菌双杂交(BACTH)分析蛋白质相互作用；采用NMR技术解析OrfM溶液结构；通过EMSA和switchSENSE技术检测DNA结合特性；并开发荧光标记的ori50/ori57底物评估松弛酶活性调控效应。

OrfL和OrfM蛋白是ICESt3接合所必需的

通过构建标记缺失的ICESt3 ΔorfL和ΔorfM突变株，接合实验显示野生型ICESt3的转移频率为1.7 × 10^-5，而突变株的接合能力完全丧失（检测阈值≤5.0 × 10^-8）。回补实验证实orfL或orfM的重新表达可完全恢复接合频率，明确了两者在ICESt3接合转移中的不可替代性。

OrfL和OrfM形成稳定的1:1复合物

SEC-MALS分析表明OrfL和OrfM在溶液中主要呈单体状态，但存在少量二聚体。BACTH实验揭示了OrfL-OrfM间的特异性相互作用，ITC测定显示其结合常数K_a达7.1 × 10⁶ M^-1（K_d ≈ 140 nM），符合单结合位点模型。switchSENSE动力学分析进一步验证了快速结合（k_on = 6.2 × 10⁴ M^-1 s^-1）与解离（k_off = 1.9 × 10^-2 s^-1）特性，确证了异源二聚体的形成。

OrfM呈现动态OB折叠结构特征

NMR解析的OrfM三维结构显示其具备典型的五链β桶OB折叠拓扑（β₁-β₂-β₃-β₄-β₅），但存在显著特性：N端额外α₀螺旋、β₁-β₂间长环（L₁₂）呈现β发夹样弯曲构象，以及缺乏β₃-β₄间封盖螺旋。弛豫动力学数据表明L₁₂和L₄₅环区存在微秒-毫秒级构象交换，提示这些柔性区域可能在与DNA或蛋白质互作中发生构象调整。

OrfL和OrfM呈现弱非特异性DNA结合能力

EMSA实验需借助低浓度多聚甲醛交联才能检测到OrfL/OrfM与ssDNA/dsDNA的结合，switchSENSE技术进一步证实了其对DNA的弱亲和性且无序列特异性。 sizing指数分析显示OrfL和OrfM均可与DNA形成复合物，但其结合力远低于经典SSB蛋白，表明二者可能通过间接机制参与DNA加工而非直接识别oriT。

OrfL作为网络枢纽连接松弛酶与解旋酶

BACTH实验显示OrfL能分别与RelSt3松弛酶和宿主PcrA解旋酶（SF1超家族）相互作用，而OrfM仅与OrfL结合。这种特异性互作网络提示OrfL可能在松弛体中发挥桥梁作用，招募PcrA至oriT区域以启动滚环复制（RCR），这与此前报道的ICEBs1中HelP蛋白增强解旋酶进程性的功能相呼应。

OrfL/OrfM调控RelSt3酶活性

质粒松弛实验和寡核苷酸切割实验均表明，OrfL和OrfM能浓度依赖性地增强RelSt3对oriT的特异性切割活性，其中OrfL的刺激作用更强，OrfL-OrfM复合物则呈现协同效应。相反，在链转移（重环化）实验中，二者显著抑制RelSt3的再连接活性。这种对切割-连接平衡的调控可能通过稳定切割中间体促进DNA转移。

本研究首次系统揭示了革兰氏阳性ICE中OB折叠蛋白作为松弛体辅助因子的功能机制。OrfL和OrfM通过形成异源二聚体，与MOB_T松弛酶RelSt3和宿主PcrA解旋酶构建功能性网络，精准调控DNA切割与再连接平衡。其非典型OB折叠结构以及弱DNA结合特性，显著区别于传统接合系统中依赖RHH结构域的辅助蛋白（如TraM、TraY等）。该发现不仅拓展了对ICE接合机制的理解，还为开发针对耐药基因传播的干预策略提供了新靶点。论文发表于《Nucleic Acids Research》，为移动遗传元件的进化与传播机制研究提供了重要理论依据。