巴西棕色蜂胶-Cu2+复合物的毒性评估：该复合物具有增强的可见光吸收能力和抗菌特性

《ACS Omega》：Toxicity Assessment of Brazilian Brown Propolis-Cu2+ Complex with Enhanced Visible-Light Absorption and Antimicrobial Properties

本研究合成了Propolis-Cu(II)复合物，通过UV-Vis、FTIR和SEM表征显示其具有增强的可见光吸收（800-900 nm）和独特结晶结构。尽管抗氧化活性降低，但复合物显著提升了对S. aureus和S. gallinarum的抗菌活性，且在果蝇模型中表现出剂量依赖性慢性毒性，LC50为3.64 mg·mL?1，毒性低于游离Cu2+，提示其作为光动力治疗（PDT）的潜力。

　　本研究聚焦于一种新型的蜂胶-铜（II）复合物的合成与表征，旨在增强其光物理特性和抗菌性能。通过一系列实验手段，包括紫外-可见光谱（UV–vis）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和扫描电子显微镜（SEM），研究人员发现了该复合物独特的吸收特性，并显著增强了铜（II）在800–900 nm波段的吸收强度。FTIR结果显示了分子间通过羰基抑制作用的相互作用，而SEM则揭示了形态变化及晶体结构的形成。尽管该复合物在抗氧化活性方面相较于原始蜂胶提取物有所下降，但其仍然保留了相当程度的活性，这可能在未来的治疗应用中具有重要意义。此外，其抗菌性能相较于纯蜂胶得到了显著提升，特别是在对金黄色葡萄球菌（S. aureus）的杀灭作用上，在较低浓度下（50.0 μg·mL?1）就表现出良好的效果，同时在对鸡沙门氏菌（S. gallinarum）方面也展现出一定的抑制作用，但对大肠杆菌（E. coli）和李斯特菌（L. monocytogenes）则没有明显的增强效果。更重要的是，通过果蝇（Drosophila melanogaster）的毒理学评估，研究人员发现该复合物表现出一种慢性且剂量依赖性的毒性特征，只有在剂量超过2.5 mg·mL?1并伴随更长时间的暴露时，才会出现致命效应，且LC50值随时间推移逐渐降低（从7.92降至3.64 mg·mL?1）。然而，这种毒性显著低于游离的铜（II）盐，归因于蜂胶对铜（II）的螯合作用，降低了其生物可利用性，并通过其自身的抗氧化活性可能缓解氧化应激。该复合物在S. aureus和S. gallinarum上的增强抗菌性能，结合其调整后的毒性特征，使其成为一种具有前景的治疗候选物，特别是在其在800–900 nm波段的增强可见光吸收特性与光动力疗法（PDT）的治疗窗口相吻合。

蜂胶作为一种天然产物，源自蜜蜂对植物分泌物、唾液分泌物和蜂蜡的混合提取，具有丰富的化学成分，包括醛类、酮类、酚酸类、酯类、黄酮类、维生素类和醇类等。这些成分赋予了蜂胶多种药理活性，如抗肿瘤、抗菌、抗真菌、抗氧化和麻醉作用。其中，蜂胶促进伤口愈合的能力尤为突出，这与其抗过敏、抗炎和抗菌特性相结合，并通过酚类化合物和酶类促进胶原蛋白形成及减少自由基生成，从而促进组织再生。在慢性伤口如溃疡的治疗中，蜂胶展现出令人鼓舞的效果，为患者提供了提高生活质量的可及且有效的治疗手段。因此，蜂胶在治疗这类伤口方面被认为是一种具有潜力的材料。

在这一背景下，蜂胶被广泛用于新型治疗手段的探索，例如光动力疗法（PDT），这是一种通过光化学反应破坏靶向组织的治疗方法。PDT的实施依赖于三个基本要素：光敏剂、光源和分子氧。光敏剂在光源照射下与分子氧反应生成活性氧物种（ROS），这些ROS对细胞具有高度毒性，从而产生治疗效果。PDT在慢性伤口治疗中已被广泛应用，特别是在对抗细菌生物膜方面，因为这些生物膜阻碍了系统性抗生素的治疗效果。最近，Ribeiro等研究者将巴西绿蜂胶与蓝光LED结合应用于PDT治疗，以对抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）在小鼠模型中的皮肤感染，显示出显著的初步效果，有效降低了感染部位的细菌载量。然而，大多数蜂胶变体在与PDT结合时仅表现出积极的协同效应，但其作为光敏剂的直接应用却受到限制，因为其在可见光区域的吸收能力较低，而可见光对于光敏剂的有效性至关重要。

铜（II）等过渡金属化合物通常在可见光区域具有良好的吸收能力，例如铜纳米颗粒已被用于PDT治疗癌症。将铜（II）与蜂胶结合形成复合物，不仅能够增强可见光吸收能力，还能调节金属的毒性，并提升其生物活性。这种协同作用在进一步应用中可能特别重要，例如作为PDT的辅助剂，利用可见光可控地生成具有细胞毒性的ROS。

然而，铜（II）离子在不受控制的情况下与毒性机制密切相关，主要通过过量的ROS生成，引发氧化应激，从而对生物分子如DNA、蛋白质和脂质造成损害。最近，一种依赖于细胞内铜（II）积累的程序性细胞死亡机制——铜诱导性凋亡（cuproptosis）被发现。铜（II）通过ferredoxin-1还原为铜（I），导致柠檬酸循环中的脂酰化蛋白聚集，最终引发线粒体崩溃。尽管在不受控制的环境中具有毒性，这一机制已被探索作为选择性诱导肿瘤细胞cuproptosis的治疗机会。

在生物模型如果蝇（D. melanogaster）中，该模型因其与人类的遗传相似性被广泛用于毒理学研究。Abolaji等研究者发现，通过D-青霉胺对铜（II）的螯合，显著降低了其毒性，并延长了暴露下的生存时间，这与配体对游离离子的结合、缓解氧化应激及促进排泄的能力相关。同样，巴西蜂胶富含酚类化合物和黄酮类物质，具有螯合位点，可以作为天然的螯合剂，与铜（II）形成稳定的复合物，从而降低其生物可利用性与毒性，通过其高抗氧化活性抑制不受控制的ROS生成，并在增强其生物活性的同时提高可见光吸收能力。

在此基础上，本研究报道了巴西棕色蜂胶提取物与铜（II）之间的反应，旨在合成一种新型的复合物，结合蜂胶的生物活性与铜的电子特性。同时，通过果蝇模型的毒理学评估，以确保其初步的毒理学安全性。这一研究连接了材料设计与生物验证，为开发天然混合化合物提供了可持续的策略，以支持先进的治疗应用。

在方法论方面，研究首先对巴西棕色蜂胶提取物进行合成，使用超声辅助浸提法，根据Contieri等的改良方法，将100克的蜂胶与300毫升的70%（体积比）水醇混合液（95%乙醇）混合，并在750 W的超声条件下处理30分钟。处理后，混合物静置48小时，再进行30分钟的超声处理，之后通过真空过滤去除杂质。滤液在冷冻条件下保存24小时，并再次真空过滤以去除蜡质。粗提取物通过旋转蒸发仪干燥，最终得到的固体重新悬浮于70%（体积比）水醇溶液中，浓度为20 mg·mL?1。

随后，研究人员制备了5%（质量体积比）的CuCl?·2H?O溶液，并在100毫升容量瓶中进行复合反应，将10毫升的CuCl?溶液与5毫升的蜂胶提取物混合，并用95%（体积比）乙醇填充至容量瓶。最终产物在40°C的烘箱中干燥24小时。

在物理化学表征方面，UV–vis吸收光谱通过Shimadzu UV-1800分光光度计获取，波长范围为200–900 nm，使用石英比色皿进行检测。样品被稀释至25毫升容量瓶中，50微升样品用于Cu-PRO复合物的分析。为了确保准确性，所有溶液均使用超纯水调整，而其他样品则使用95%乙醇进行调整。通过线性回归法，研究人员确定了复合物在0.2–1.5 mg·mL?1浓度范围内的消光系数（ε），使用朗伯-比尔定律进行计算。FTIR光谱通过PerkinElmer Frontier光谱仪在ATR模式下获取，波长范围为4000–650 cm?1，使用固体样品进行检测。形态分析则通过Hitachi TM-3000扫描电子显微镜进行，同样使用固体样品。

在体外抗氧化活性评估中，研究采用两种金属离子还原方法：CUPRAC（铜离子还原抗氧化能力）和FRAP（铁离子还原抗氧化能力）。由于铜（II）的存在，其他方法如自由基清除能力（如DPPH和ABTS）显示出较大的干扰性。总等效量通过公式计算，其中E代表浓度等效值，C·V代表样品在反应中的质量含量，即初始样品浓度（C）与样品体积（V）的乘积。最终结果以每克样品的抗氧化物质等效于抗坏血酸的毫克数（mg of AAE·g?1）表达。

此外，FRAP方法通过Rufino等的改良方案进行，为制备250毫升的FRAP试剂，将208.30毫升的0.3 M乙酸缓冲液（pH ～ 3.6）、20.80毫升的2,4,6-三（2-吡啶基）-s-三嗪（TPTZ）溶液（10 mmol L?1）和20.80毫升的FeCl?·6H?O溶液（20 mmol L?1）混合。在反应管中，加入90微升的样品和270微升的超纯水，再加入2700微升的FRAP试剂，混合后在恒温浴中保持37°C处理30分钟，避免光照。处理后，于595 nm处测量吸光度。使用Fe2?（FeSO?·7H?O，2.0 mM）作为标准，超纯水作为空白对照。所有分析均在R软件（v. 4.4.2）中进行，以确保准确性。

在体外抗菌活性评估中，采用最低抑菌浓度（MIC）法，通过96孔板进行连续微稀释，遵循临床和实验室标准协会（CLSI）指南。样品、蜂胶提取物、CuCl?和Cu-PRO均测试了对多种细菌的抗菌效果，包括革兰氏阳性菌：S. aureus（ATCC 25923）和L. monocytogenes（ATCC 19111）；以及革兰氏阴性菌：E. coli（ATCC 25922）和Salmonella enterica serovar Gallinarum（ATCC 9184）。菌液浓度通过麦氏比浊法调整，并使用分光光度计（PerkinElmer，Waltham, MA）在625 nm处测量，以达到最终浓度1.5 × 10? CFU·mL?1。

样品的制备浓度为200 μg·mL?1（质量体积比），使用10%乙醇作为溶剂。稀释后，加入100 μL的培养基（Mueller-Hinton）和20 μL的菌液，然后在37°C下培养24小时。培养后，加入20 μL的2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（0.125%质量体积比，乙醇溶液），再培养2小时，以确定MIC。氯霉素（1.2 mg·mL?1）作为阳性对照，10%乙醇作为阴性对照，培养基作为生长对照。

在体外测试中，观察到蜂胶提取物对E. coli表现出强烈的抗菌活性（MIC = 12.5 μg·mL?1），而对L. monocytogenes则具有较好的活性（MIC = 50.0 μg·mL?1）。同时，其对S. aureus和S. gallinarum的抗菌效果较为温和（100 μg·mL?1）。在对比实验中，CuCl?和Cu-PRO对S. aureus和S. gallinarum表现出相似的抑制效果，但对E. coli和L. monocytogenes则较为温和（100 μg·mL?1）。特别值得注意的是，Cu-PRO在较低浓度下（50.0 μg·mL?1）对S. aureus表现出杀菌作用，而CuCl?则表现出抑菌作用。这种复合物能够协同两种物质的抗菌效果，从而在对抗这些细菌方面增强蜂胶的活性。然而，在对抗E. coli和L. monocytogenes时，并未观察到显著的增强效果。

铜化合物在抗菌作用方面被广泛认可，其作用机制通过多种协同毒性机制实现。这些机制赋予了铜作为抗菌剂在农业、工业和医疗领域的广泛应用，但其使用仍需谨慎，因为可能带来毒性和环境影响。根据Salah等的研究，铜诱导的氧化应激是其抗菌作用的主要机制之一，通过Fenton样反应生成ROS，这些ROS对关键细胞成分如膜、蛋白质和遗传物质造成氧化损伤。此外，铜还通过破坏微生物DNA而具有基因毒性。最后，铜结合到功能蛋白基团（如巯基、咪唑基和羧基）上，使关键酶失活，从而干扰重要的生化过程。

在果蝇模型中的毒理学评估表明，尽管铜是一种代谢过程中必需的微量元素，但在较高浓度下会表现出显著的毒性，通过促进ROS生成，增加氧化应激，从而导致细胞损伤和cuproptosis机制。因此，毒理学评估对于定义效率、适当使用和毒性的安全范围至关重要，以确保安全应用的开发。在文献中，铜化合物在果蝇中的毒性已被广泛研究。尽管理论上的LC50值不常见，但Klimaczewski等的研究提供了参考值，涉及铜（II）的毒性。作者报告了CuSO?形式的LC50值为3 mM，相当于约0.191 mg·mL?1的游离Cu（II）离子，通过4天的急性暴露确定。这种参考值也被Halmenschelager等和Ioan等所引用和证实。其他研究则探讨了铜毒性在较长暴露时间或不同化学形式下的影响。Abolaji等评估了铜（II）与D-青霉胺螯合后的慢性（7天，1 mM Cu（II））和急性（24小时，10 mM）暴露对果蝇的影响。螯合作用导致了比纯铜盐更长的存活时间，但未提及具体的数值或比较毒性参数。与此同时，Carmona等研究了CuO-NPs（氧化铜纳米颗粒）和CuSO?对幼虫发育的影响，观察到在浓度范围0.24–7.5 mg·mL?1时的氧化和基因毒性。

因此，使用Klimaczewski等的参考值作为Cu（II）的LC50值，尽管在理论上摩尔比估算下，Cu-PRO的铜含量较高（约310 mgCu·g?1），其在果蝇中的毒性仍显著低于参考值中的游离Cu（II）盐。这反映了元素的生物可利用性以及化学形式对金属毒性作用的影响。然而，复合物中的真正铜含量是理论估算，因此这种比较可能仅限于定性层面。

显著降低的毒性可能与巴西棕色蜂胶的内在抗氧化特性密切相关。蜂胶因其丰富的抗氧化成分，特别是多种黄酮类化合物和酚酸类物质（如咖啡酰奎宁酸、p-肉桂酸），表现出强大的自由基清除能力。体外抗氧化实验的结果表明，Cu-PRO复合物尽管因铜结合而发生了结构变化，但其仍然保留了相当的抗氧化能力。这表明蜂胶的抗氧化成分可能有效缓解铜诱导的氧化应激，从而延迟毒性。蜂胶的配体不仅能够螯合Cu（II），还可能将其稳定在更少反应性的形式，减少其参与Fenton样反应的能力，从而调节ROS的生成。此外，蜂胶中的抗氧化成分可能直接中和铜积累过程中产生的ROS，保护细胞成分（如脂质、蛋白质和DNA）免受即时氧化损伤。这可能会延迟死亡的出现，并减少急性毒性，如Kaplan–Meier生存曲线所示，在更高剂量（>2.5 mg·mL?1）和更长时间暴露下才会观察到显著的毒性效应。

这种保护作用与之前关于其他金属螯合抗氧化剂（如Abolaji等的研究）的研究相一致，但突显了蜂胶的优势，即其多组分组成能够提供双重协同作用，即螯合与抗氧化活性的结合，可能使其比合成螯合剂更有效。因此，游离Cu（II）离子的生物可利用性降低，结合持续的ROS清除作用，很可能解释了Cu-PRO在果蝇中的LC50值高于参考值，并表现出延迟的慢性毒性特征，如在时间依赖性下LC50值的降低。

综上所述，蜂胶与铜（II）的复合物在光化学性质和抗菌性能方面展现出显著的潜力。虽然其抗氧化活性相较于原始蜂胶有所下降，但保留了足够的活性，这为未来的治疗应用提供了可能性。同时，其抗菌效果在某些细菌上有所增强，特别是对S. aureus和S. gallinarum，优于纯蜂胶和CuCl?，但在E. coli和L. monocytogenes上没有明显增强。此外，毒理学评估显示其毒性在果蝇模型中表现出剂量依赖性，只有在剂量超过2.5 mg·mL?1并在更长时间的暴露下才会出现显著毒性。通过参数模型的拟合，研究发现其非单调性危害特征，每增加1 mg·mL?1剂量，果蝇的平均寿命减少约23%。然而，由于所有参数模型均未符合精确的指数分布（p < 0.05），因此参数模型只能在6天的实验时间内进行评估。尽管如此，Cu-PRO的毒性仍显著低于参考值中的游离Cu（II）盐，这可能归因于螯合作用降低了金属的生物可利用性，以及蜂胶的抗氧化活性缓解了氧化应激。

这些研究结果使Cu-PRO成为一种具有潜力的抗菌剂，其在治疗中的效果与安全性之间达到了良好的平衡。未来的研究将聚焦于可见光诱导的抗菌机制、光动力效应以及光激活与可控铜释放之间的协同作用，以增强其生物应用。这种策略可能为蜂胶作为抗菌和螯合剂的创新应用铺平道路，提升金属复合物的生物活性。