用于血清人铁蛋白轻链（FTL）SI可追溯定量的物种特异性同位素稀释方法

《Analytical Chemistry》：Species-Specific Isotope Dilution Methodology for the SI Traceable Quantification of Serum Human Ferritin Light Chain (FTL)

血清铁轻链（FTL）硫同位素稀释分析（SS-IDA）新方法研究及其在WHO标准物中的应用。通过重组表达天然和富集3?S的FTL标准品，优化甲醇沉淀结合热处理和超滤的样本前处理，结合不对称场流色谱（AF4）和阴离子交换HPLC-ICP-MS联用技术，首次在低丰度生物标志物中实现SI可追溯值的准确测定，相对标准不确定度达9.4%。

　　

目前迫切需要建立参考方法，以便为蛋白质生物标志物的质量控制（QC）材料赋予可追溯的国际单位制（SI）数值，从而验证目前用于疾病诊断和患者特异性治疗的生化检测方法。本文介绍了一种专门开发的新方法，用于可追溯地定量测定人血清铁蛋白轻链（FTL）的浓度。FTL是一种已确立的生物标志物，用于诊断与铁相关的疾病，如血色素沉着症。天然FTL和³⁴S同位素富集的FTL标准品是通过HEK-293哺乳动物细胞系统重组表达的。在使用这些标准品进行同位素稀释分析（IDA）之前，对其总硫含量、同位素丰度、物种分布和一级序列进行了全面表征。对添加了FTL的血清进行处理时，优化了处理方法，以选择性去除高丰度的血清蛋白，同时不显著影响FTL的完整性。该方法结合了甲醇蛋白沉淀、热处理和超滤技术来实现这一目标。此外，还使用了互补的非对称场流分离（AF4）技术和阴离子交换高效液相色谱（AE-HPLC），并与电感耦合等离子体质谱（ICP–MS）联用，以监测样品处理对蛋白质去除和FTL回收率的影响。无论是天然FTL还是富集FTL标准品，在经过最佳处理的样品中，均采用双物种特异性同位素稀释分析（SS-IDA）流程进行测定，结果符合世界卫生组织（WHO）“第四版铁蛋白国际标准”（NIBSC 19/118）的要求，得到的蛋白质质量分数为11.0%，扩展不确定度（U, k = 2）为1.0 μg/mL^–1（相对标准偏差为9.4%）。该方法通过加标实验进行了验证，并建立了完整的不确定度评估体系。这是首次利用硫同位素稀释分析方法为WHO标准中生理浓度范围内的相对低丰度血清蛋白生物标志物赋予可追溯的SI数值。这一方法对于为现有QC材料添加SI可追溯性以及新生物标志物参考材料的认证具有重大价值。