在II型糖尿病的小鼠模型中，血小板的生物能量代谢与骨骼肌的呼吸作用存在关联

《Frontiers in Molecular Biosciences》：Platelet bioenergetics correlate with skeletal muscle respiration in a murine model of type II diabetes

线粒体生物能学研究显示，血小板可作为小鼠骨骼肌代谢紊乱的微创生物标志物。通过优化XFe24和O2k实验方法，发现db/db糖尿病小鼠血小板基础呼吸速率、ATP关联呼吸和最大呼吸速率均显著高于对照组，而骨骼肌存在复合物I+II呼吸链缺陷和泄漏呼吸降低。多个关键呼吸参数在血小板与骨骼肌间呈现显著相关性（r=0.28-0.61，p<0.05），证实血小板代谢状态可反映骨骼肌线粒体功能。本研究为代谢性疾病诊断提供了新方法学框架。

　　本研究聚焦于探索血小板是否能够作为骨骼肌线粒体呼吸功能的非侵入性替代指标，特别是在小鼠模型中。传统上，研究骨骼肌线粒体功能通常需要进行肌肉活检，这种方法不仅侵入性强，还可能引发疼痛、过敏反应以及操作上的复杂性，尤其是在糖尿病患者中。为了克服这些限制，我们采用了一种创新的方法，利用高分辨率呼吸测量技术（O2k）评估小鼠白肌胃肌（gastrocnemius）组织的线粒体功能，同时使用Seahorse外源性通量分析（XFe24）测量血小板的呼吸参数。通过对比健康C57BL/6J小鼠与糖尿病模型小鼠（db/db）的血小板和肌肉线粒体功能，我们发现血小板的呼吸参数与肌肉组织存在显著相关性，这为未来的临床研究提供了新的方向。

### 线粒体在代谢疾病中的作用

线粒体是细胞中负责能量代谢的核心器官，其功能在多种代谢疾病中受到严重影响。例如，在2型糖尿病（T2DM）和心血管代谢疾病（CMD）的发展过程中，线粒体功能障碍往往成为关键的病理机制之一。这些疾病通常伴随着胰岛素抵抗、氧化应激以及线粒体耦合效率的下降，导致细胞能量代谢失衡。而骨骼肌作为体内最大的胰岛素敏感组织，其线粒体功能的恶化在这些疾病中尤为明显。因此，对骨骼肌线粒体功能的评估对于理解代谢紊乱的机制和开发有效的干预策略至关重要。

然而，由于骨骼肌活检的局限性，研究人员往往难以在大规模人群中进行常规监测。而血小板作为一种易获取、数量丰富且高度代谢活跃的细胞碎片，被认为可能是线粒体功能的“液体活检”替代物。它们不仅易于从血液中分离，而且在病理状态下的变化可能反映出组织层面的代谢异常。此外，血小板缺乏细胞核，使得它们成为研究线粒体DNA影响线粒体功能的理想工具。这一特性为探索线粒体功能与遗传、表观遗传以及环境因素之间的关系提供了便利。

### 血小板与骨骼肌线粒体功能的关联性

本研究首次在小鼠模型中系统评估了血小板与骨骼肌线粒体功能之间的关联性。通过对健康C57BL/6J小鼠和db/db糖尿病模型小鼠的实验，我们发现血小板的多个呼吸参数，如基础呼吸率（OCR basal）、ATP相关呼吸（OCR ATP）、质子漏（OCR leak）以及最大呼吸率（OCR max）与骨骼肌线粒体功能存在显著相关性。这表明，血小板的线粒体活动可能反映了组织层面的代谢状态，尤其是在健康和糖尿病状态下。

具体而言，在db/db小鼠中，血小板的OCR basal和OCR ATP显著高于健康对照组，而质子漏（OCR leak）也有所增加。尽管血小板的耦合效率（CE）在两组之间没有显著差异，但其与骨骼肌线粒体复合物I（CI）活性存在正相关。这一发现表明，血小板的耦合状态可能与骨骼肌中复合物I的呼吸能力相关联，进一步支持了血小板作为线粒体功能替代指标的潜力。此外，血小板的储备能力（ResCap）在健康小鼠中并未表现出显著变化，但在糖尿病模型中，尽管基础呼吸率和最大呼吸率增加，ResCap却没有明显差异，这可能与细胞对能量需求的适应性有关。

### 研究方法与优化

为了确保血小板线粒体功能测量的准确性，我们进行了详尽的方法优化。首先，通过离心法从全血中分离出富含血小板的血浆（PRP），并使用一种特殊的缓冲液（含PGI2）来防止血小板激活和聚集。随后，将PRP进一步离心，以去除红细胞并富集血小板。通过这一过程，我们能够获得高质量的血小板样本，从而保证后续实验的可靠性。

在进行Seahorse XFe24实验时，我们特别关注了细胞播种密度的优化。通过调整播种密度，我们发现较高的细胞密度可能导致测量腔内的氧气耗尽，从而影响实验结果的稳定性。因此，我们最终确定了20 × 10^6个血小板/孔的播种密度，以避免因氧气耗尽引起的假阴性结果。此外，我们还优化了实验条件，包括减少培养时间、确保细胞层在测量前保持稳定等，以提高数据的一致性和可重复性。

在骨骼肌线粒体功能的评估中，我们使用了O2k仪器进行高分辨率呼吸测量。通过在特定的缓冲液（BIOPS）中对肌肉纤维束进行渗透化处理，我们能够测量其线粒体呼吸参数，如CI OXPHOS、CI + CII OXPHOS（P）、LEAK（L）、ATP-linked呼吸、CE（%）以及呼吸控制比（RCR）。为了减少技术偏差，我们还对实验数据进行了严格的背景校正和非线粒体呼吸的扣除。此外，我们还评估了CIV（复合物IV）活性，以进一步验证线粒体功能的改变是否具有普遍性。

### 研究结果与意义

研究结果表明，db/db糖尿病模型小鼠的血小板显示出增强的线粒体呼吸能力，这与骨骼肌线粒体功能的下降形成了对比。具体而言，db/db小鼠的血小板OCR basal和OCR ATP显著升高，而骨骼肌的CI + CII OXPHOS和LEAK呼吸率则降低。这一现象可能反映了糖尿病引起的代谢紊乱在不同组织中的差异化表现。值得注意的是，血小板的CE（%）与骨骼肌的CI OXPHOS存在正相关，这提示我们血小板的耦合状态可能与骨骼肌的复合物I功能密切相关。

此外，我们还发现血小板的呼吸参数与骨骼肌的多个指标存在显著的统计学关联。例如，血小板的基础呼吸率（OCR basal）与骨骼肌的CI + CII OXPHOS呈负相关，而血小板的ATP相关呼吸（OCR ATP）与骨骼肌的ATP-linked呼吸呈正相关。这些发现不仅揭示了血小板与骨骼肌线粒体功能之间的潜在联系，还为未来的临床研究提供了理论依据。特别是在无法进行组织活检的情况下，血小板可能成为评估代谢状态的可靠工具。

### 未来展望与应用

本研究为血小板作为骨骼肌线粒体功能的“液体活检”替代指标提供了初步的证据。然而，这一方法仍需进一步验证其在人类中的适用性。目前，已有研究表明，在人类中血小板的呼吸参数与骨骼肌功能存在一定的相关性，但这些研究多集中在健康人群，而对CMD患者的关联性尚未完全明确。因此，未来的研究应关注血小板线粒体功能是否能够在糖尿病等代谢疾病早期阶段反映骨骼肌的代谢变化，从而为疾病的早期诊断和干预提供新的思路。

此外，本研究还揭示了血小板与骨骼肌线粒体功能之间的复杂关系，这种关系可能受到多种因素的影响，包括遗传背景、环境暴露以及代谢状态。因此，在开发基于血小板的生物标志物时，需要考虑这些变量对结果的潜在影响。同时，研究还发现，血小板的呼吸参数在不同亚型肌肉（如快肌和慢肌）中的表现可能存在差异，这提示我们未来的研究应关注不同肌肉类型对线粒体功能的响应。

总之，本研究不仅为血小板作为线粒体功能替代指标的可行性提供了实验支持，还为未来在人类中应用这一方法奠定了基础。通过进一步优化实验方法和扩大样本范围，血小板线粒体功能分析有望成为一种非侵入性的、高灵敏度的工具，用于评估代谢状态和预测疾病进展。这一研究结果对于推动精准医学的发展具有重要意义，尤其是在糖尿病等慢性代谢疾病的早期诊断和治疗策略制定方面。