拯救残余种群：极度濒危淡水贻贝属Plethobasus的保护基因组学研究

《Conservation Genetics》：Saving what’s left: conservation genomics of Plethobasus, a critically endangered genus of freshwater mussel

本研究针对淡水贻贝属Plethobasus中三种联邦濒危物种，通过保护基因组学方法评估了P. cooperianus和P. cyphyus的遗传多样性，并对疑似P. cicatricosus样本进行分子鉴定。研究发现P. cooperianus为单一随机交配种群，而P. cyphyus存在两个独立种群。虽然未确认疑似样本为P. cicatricosus，但研究结果为该属物种的保育活动提供了关键的遗传学依据，强调了将遗传信息纳入濒危物种恢复计划的重要性。

　　

在北美淡水生态系统中，淡水贻贝（Order Unionida）作为水生生物多样性的重要组成部分，正面临着前所未有的生存危机。据统计，美国约300种本土淡水贻贝中已有10%灭绝，剩余物种中约60%处于濒危状态。尽管保护工作者积极开展恢复工作，但缺乏遗传学指导的保育活动可能适得其反。其中，Plethobasus属包含三种联邦濒危物种：P. cooperianus（橙足疙瘩蚌）、P. cyphyus（绵羊鼻蚌）和极度罕见的P. cicatricosus（白疣背蚌），它们的生存状况尤为令人担忧。

这些贻贝种群面临的主要威胁包括栖息地改变和退化等人类活动影响，导致其分布范围急剧缩小，种群高度碎片化。孤立的小种群容易受到近交衰退、遗传漂变和遗传负荷增加的影响，进而导致有害等位基因积累、适应潜力丧失以及对环境变化的恢复力下降。尽管《美国濒危物种法案》（ESA）要求基于"最佳可得科学数据"制定恢复计划，但在实际操作中，淡水贻贝的增殖、再引入和迁移活动往往缺乏遗传学考量，这可能引发远交衰退，稀释本地适应等位基因，反而对野生种群造成负面影响。

针对这一保护遗传学领域的空白，研究人员开展了一项针对Plethobasus属的保护基因组学研究。该研究旨在：（1）量化现存P. cooperianus标本的遗传变异和种群结构；（2）比较P. cooperianus和P. cyphyus的遗传变异；（3）通过分子手段验证形态学鉴定的疑似P. cicatricosus个体的分类身份。这项研究对于指导该极度濒危属的保育活动具有重要意义，相关成果发表在《Conservation Genetics》期刊上。

研究方法主要包括：采用非破坏性拭子采样法获取活体贻贝DNA样本；通过线粒体细胞色素c氧化酶亚基I（COI）和NADH脱氢酶亚基I（NDI）基因测序分析遗传多样性；利用2bRAD（2b限制性位点相关DNA测序）技术进行基因组规模的单核苷酸多态性（SNP）分型；采用多种分析方法（F_ST、ADMIXTURE、DAPC）评估种群结构；基于最大似然法构建系统发育树进行物种鉴定。

样本收集与DNA提取

研究人员从该属分布范围内的多个地点采集了活体贻贝样本，使用无菌口腔拭子刷取贻贝足部组织进行非破坏性DNA采样。共采集31个P. cooperianus个体（25个来自俄亥俄河，6个来自田纳西河）和18个P. cyphyus个体（来自田纳西河），此外还获得了来自密西西比河的10个P. cyphyus样本以及一个形态学鉴定的疑似P. cicatricosus个体。所有拭子样本均采用改良的细胞裂解和蛋白酶K方法进行DNA提取，并通过凝胶电泳评估DNA质量。

mtDNA测序与遗传多样性分析

成功对P. cooperianus和P. cyphyus的线粒体COI和NDI基因进行测序，并使用DNAsp软件计算种群和统计指数。通过TCS软件构建最大简约网络，评估单倍型分布模式。对于疑似P. cicatricosus样本，由于仅有一个个体，未进行种群水平分析。

RADseq文库制备与SNP发现

采用AlfI限制性内切酶进行2bRAD文库构建，经过适配器连接和条形码添加后，在Illumina HiSeq 4000平台上进行测序。使用STACKS软件进行基因分型和SNP发现，参数设置参考r80方法优化。共生成三个独立数据集：P. cooperianus数据集、P. cyphyus数据集以及包含两个物种和疑似样本的三物种数据集。

种群遗传变异与系统发育分析

使用HIERFSTAT软件计算种群间F_ST值，并通过ADMIXTURE和DAPC分析种群结构。利用DARTR和DIVERSITY软件包计算观察杂合度、期望杂合度、等位基因丰富度和近交系数等种群遗传参数。通过NeEstimator软件基于连锁不平衡方法估算有效种群大小（N_e）。分别基于串联mtDNA数据和SNP数据，使用IQ-TREE软件构建最大似然系统发育树，评估节点支持度。

mtDNA测序、遗传多样性和种群统计

研究发现P. cooperianus和P. cyphyus的遗传多样性水平相似，但两物种的种群历史存在明显差异。P. cooperianus的COI和NDI基因均显示出近期种群扩张的特征，Tajima's D、Fu's F和R₂统计值均达到显著水平。单倍型网络呈现星状结构，进一步支持了近期扩张的假设。相比之下，P. cyphyus仅显示出微弱的扩张证据，且主要来自田纳西河种群。两种群的线粒体DNA均未显示出明显的地理结构，单倍型在河流系统间混合分布。

RADseq采样与SNP发现

成功对26个P. cooperianus、22个P. cyphyus和疑似P. cicatricosus个体进行了基因分型。经过过滤后，保留3,527个SNP用于P. cooperianus种群推断，2,479个SNP用于P. cyphyus分析。三物种系统基因组数据集包含的SNP数量随r参数设置（0.5-1.0）而变化，从83到4,582个不等，但不同参数设置对下游系统发育树构建的影响不大。

RADseq摘要统计与种群结构

分析显示P. cooperianus在俄亥俄河和田纳西河采集点之间不存在有意义的种群结构。DAPC和ADMIXTURE分析均支持K=1为最可能值，种群间F_ST值为0.0023，置信区间包含零，表明两个已知种群的P. cooperianus存在随机交配模式。相反，P. cyphyus在两个河流中拥有遗传分化的种群。DAPC和ADMIXTURE分析均支持K=2为最可能值，种群间F_ST值为0.11，达到统计显著水平。两种群的遗传多样性指标（H_e、π、F_IS）相似，但有效种群大小存在差异：密西西比河种群的N_e（297.8）显著低于P. cooperianus（2,177.1）和田纳西河P. cyphyus种群（2,338.8）。

疑似P. cicatricosus样本的鉴定

系统发育分析结果不支持形态学鉴定的疑似P. cicatricosus样本的分类身份。基于mtDNA和SNP数据的系统发育重建显示，该样本嵌套在P. cyphyus内部，更具体地说，位于田纳西河P. cyphyus种群的支系中。mtDNA系统发育树强烈支持P. cooperianus和P. cyphyus为单系群，疑似样本完全落入P. cyphyus支系。SNP系统基因组树进一步证实了这一结果，并显示出更高的分辨率，能区分P. cyphyus内的种群水平支系，但P. cooperianus内未发现类似结构。

研究结论与讨论部分强调，尽管Plethobasus属物种面临严重的生存威胁，但其遗传多样性水平与常见且非濒危的淡水贻贝物种相似，表明大规模种群衰退对遗传多样性的侵蚀性影响尚未完全显现。这一现象可能源于长世代时间对近期瓶颈事件的掩盖作用，或是对某些未被发现的遗传多样性储库的指示。

对于P. cooperianus，现存个体组成一个跨越俄亥俄河和田纳西河的单一随机交配种群。考虑到该物种已知个体数量极少，增殖可能是成功恢复该物种的唯一途径。在这种情况下，利用来自任一河流或两个河流的亲鱼资源，遗传负面风险均较小。从保护三R（表征、冗余和恢复力）框架分析，P. cooperianus的表征和冗余性较低，但恢复力可能略高，因为尽管种群严重衰退，其遗传组成仍保持较高水平。

对于P. cyphyus，研究支持其由分布在不同河流中的多个遗传独特种群组成。这种强烈的种群结构应在亲鱼来源选择和迁移活动中予以考虑。个体应仅与同一遗传种群内的其他个体繁殖，以最大限度降低有害遗传影响的风险。与P. cooperianus相比，P. cyphyus的表征和冗余性更高，但恢复力可能相似。

尽管研究结果不支持疑似样本为P. cicatricosus，但这并不质疑该物种的有效性，而是强调了在难以区分的物种中进行遗传验证的重要性，以确保保护资源不被错置，增殖活动中不会发生潜在杂交事件。

该研究为Plethobasus属的保护提供了关键信息，确定了保护单元，同时告知保护界将遗传信息纳入保护行动的重要性。研究结果可直接应用于物种恢复策略的制定，指导亲鱼选择、增殖和迁移活动，最大限度地降低远交衰退风险，保护本地适应等位基因，确保长期计划效力。对于正处于灭绝边缘的Plethobasus属来说，这项研究为其保护提供了科学基础，是保护生物学在危机情境下的重要实践。