通过核磁共振光谱法（NMR-Spectroscopy）解析含有醚键的双黄酮结构——对Loniflavone和Methyloniflavone结构的修正

《Magnetic Resonance in Chemistry》：Structure Elucidation of Biflavones With Ether Bonds by NMR-Spectroscopy—Structure Revisions of Loniflavone and Methylloniflavone

通过NMR光谱技术（包括HMBC和DIS方法）重新解析了从金银花（Lonicera japonica）叶中分离的双黄酮化合物，发现此前报道的loniflavone和methylloniflavone实为ochnaflavone和methylochnaflavone的异构体，纠正了文献中的结构错误。

　　在本研究中，科学家们对从忍冬（*Lonicera japonica*）叶中分离出的两种双黄酮类化合物的结构进行了重新评估，并指出它们的结构需要修正。此前，这些化合物被分别命名为“loniflavone”和“methylloniflavone”，但经过深入的核磁共振（NMR）分析后，研究团队确认其正确的结构应为“ochnaflavone”和“methylochnaflavone”。这一发现不仅对天然产物化学领域具有重要意义，也强调了在结构解析过程中使用正确共振归属的重要性。

双黄酮是一类由两个黄酮单体通过碳-碳键或醚键连接而成的化合物。其中，通过醚键连接的双黄酮在NMR谱图中通常表现出独特的特征，例如在HMBC（异核多键相关）实验中难以观察到四键相关的信号，而在NOESY（核磁共振相关）实验中也难以出现交叉峰。因此，确定醚键的具体位置成为结构解析的关键。研究团队采用了两种无需对化合物进行衍生化的NMR方法，从而能够更准确地识别双黄酮的结构。

第一种方法依赖于对单体黄酮的化学位移值进行比较。如果两个黄酮单体的结构已经被正确解析，那么可以通过它们在相同溶剂中的碳化学位移数据与双黄酮中相应位置的碳化学位移进行对比，从而确定醚键的连接点。例如，对于研究中的化合物，通过比较其与已知的单体黄酮的碳化学位移值，研究团队发现其结构与“loniflavone”并不一致，而更符合“ochnaflavone”的特征。这一方法在已知单体结构的情况下具有较高的准确性，但在缺乏单体信息时，可能难以应用。

第二种方法则基于对酚羟基质子化状态的分析，通过观察差异同位素位移（Differential Isotope Shift, DIS）来判断氧原子是否属于自由的羟基（OH）或被甲基化的氧（OD）。当向样品中加入水（H?O）和重水（D?O）后，与自由羟基相连的碳原子的化学位移值会发生显著变化（通常超过0.2 ppm），而位于醚桥末端的碳原子则表现出较小的变化或无变化。这种方法特别适用于那些无法获得单体信息的双黄酮，且其灵敏度高于传统的解析方法，尤其适合用于微量天然产物的结构鉴定。

在本研究中，研究团队利用这两种方法对从忍冬叶中分离出的两种双黄酮化合物进行了详细的分析。通过比较其碳化学位移值与已知单体黄酮的数据，以及分析其在不同溶剂中的差异同位素位移，最终确认了化合物1的结构为“ochnaflavone”，即其黄酮单体中的B环通过醚键连接至另一黄酮单体的C-3′位置。同样，化合物2的结构也被修正为“methylochnaflavone”，其甲氧基位于C-4′位置。

值得注意的是，这一修正不仅适用于本研究中的化合物，也适用于其他植物中可能被错误鉴定为“loniflavone”的双黄酮类物质。例如，之前有研究声称从*Caesalpinia pyramidalis*（尖叶木棉）中分离出了“loniflavone”，但该研究中所使用的NMR数据与本研究中的结果存在明显差异。特别是，该研究中化合物的碳化学位移值与通过总合成方法获得的“ochnaflavone”数据更为一致，这表明所谓的“loniflavone”实际上应为“ochnaflavone”。因此，该研究强调了在植物来源化合物的结构鉴定过程中，对溶剂条件和数据准确性的重视。

此外，研究团队还提出了一种基于差异同位素位移的NMR解析方法，这种方法不仅提高了结构解析的准确性，还适用于那些仅能以微量形式存在的天然产物。这种方法在传统方法无法有效解析时显得尤为重要，因为它能够在不依赖单体信息的情况下，通过分析化合物中氧原子的化学位移变化，判断其是否为自由羟基或醚桥的一部分。这种方法的高灵敏度使其成为天然产物化学中结构解析的重要工具。

在实验方法方面，研究团队采用了多种技术手段对双黄酮进行分离和鉴定。首先，通过超高效液相色谱-光电二极管阵列检测-电喷雾电离质谱（UHPLC-PDA-ESI-MS）分析，他们确定了目标化合物的分子量，并将其分别鉴定为*m/z* 537（化合物1）和*m/z* 551（化合物2）。随后，利用核磁共振技术进一步确认了其结构特征。在NMR分析中，研究团队不仅记录了化合物的1H和13C谱图，还采用了二维NMR技术，如HSQC（异核单量子相干）和HMBC（异核多键相关），以更精确地归属碳和氢的信号。

在实际操作中，研究团队对化合物1和2进行了详细的NMR分析。对于化合物1，他们使用了700 μL的吡啶-d?作为溶剂，并记录了1H、13C、DQF-COSY（双重量子相关）、HSQC和两个优化的HMBC实验（分别用于8 Hz和2 Hz的异核耦合常数）。对于化合物2，他们同样使用了1H、DQF-COSY、HSQC和HMBC实验。为了进一步提高解析的准确性，研究团队还对化合物1进行了水和重水的对比实验，通过观察其13C谱图的变化，判断哪些碳原子与自由羟基相连，哪些则属于醚桥结构。

在结构解析过程中，研究团队发现，传统的1D碳谱图在高度取代的苯环结构中可能仅能提供粗略的化学位移估计，而无法提供准确的归属信息。因此，他们强调，应优先使用二维NMR技术，如HSQC和HMBC，以确保结构解析的准确性。此外，对于化合物2，其1D碳谱图和HMBC数据表明，甲氧基的信号与C-4′位置的碳共振相关，这进一步支持了其结构为“methylochnaflavone”的结论。

研究团队还指出，之前的文献中存在一些结构鉴定上的错误。例如，在早期的文献中，一些合成产物被错误地命名为“ochnaflavone”或其甲基衍生物，而这些结构实际上并不正确。此外，在对化合物1的结构解析过程中，由于缺乏对二维HMBC谱图的正确归属，导致了结构鉴定的偏差。这些错误表明，在天然产物的研究中，仅依赖一维NMR数据可能无法准确解析复杂的结构，尤其是在双黄酮这类具有多个取代基的化合物中。

本研究不仅纠正了两个双黄酮化合物的结构，还提供了一种更有效的NMR解析方法，特别是在缺乏单体信息的情况下。通过差异同位素位移的分析，研究团队能够在不进行化合物衍生化的前提下，准确判断醚桥的连接位置。这种方法的广泛应用将有助于提高天然产物结构鉴定的效率和准确性，特别是在处理微量样品或复杂结构时。

此外，研究团队还提到，此前已有研究报道了“ochnaflavone”及其4′-甲基衍生物在忍冬的地上部分中存在，这与本研究的发现相吻合。这表明，尽管在某些文献中“loniflavone”和“methylloniflavone”被广泛引用，但实际的结构可能应为“ochnaflavone”和“methylochnaflavone”。因此，这一研究不仅提供了新的结构信息，也对已有文献中的命名进行了修正。

在实验数据方面，研究团队详细记录了化合物1和2的NMR数据，并将其与已知的单体黄酮（如luteolin和apigenin）的NMR数据进行了对比。这些数据表明，化合物1的结构与“loniflavone”存在显著差异，而更符合“ochnaflavone”的特征。同样，化合物2的结构也与“methylloniflavone”不一致，而应为“methylochnaflavone”。

研究团队还对实验条件进行了详细说明。例如，在分离化合物1和2时，他们使用了乙醇提取法，并通过固相萃取（SPE）和高效液相色谱（HPLC）技术进行纯化。在NMR分析中，他们使用了特定的溶剂（如吡啶-d?和重水）以提高解析的准确性。同时，他们还采用了水门序列来抑制水信号，以确保获得清晰的NMR谱图。

总的来说，本研究通过结合多种NMR技术，包括一维和二维谱图，以及差异同位素位移分析，成功地修正了两种双黄酮化合物的结构。这一发现不仅对天然产物化学领域具有重要的参考价值，也为后续的结构鉴定提供了新的方法和思路。研究团队的结论强调了正确共振归属在结构解析中的关键作用，并指出在缺乏单体信息的情况下，利用差异同位素位移的方法可以有效提高解析的准确性。此外，该研究还揭示了文献中可能存在的结构鉴定错误，提醒研究者在解析天然产物时应更加谨慎，确保数据的准确性和可靠性。