通过噬菌体展示技术获得的针对抗菌肽FsPDF2的抗体揭示了欧洲山毛榉的应激反应

《Plant Biotechnology Journal》：Phage Display Derived Antibodies Against Antimicrobial Peptide FsPDF2 Reveal Stress Response in European Beech

植物 defensins 是植物免疫的重要组分，本研究利用噬菌体展示技术制备针对山毛榉 FsPDF2 的单克隆抗体，并通过 ELISA 检测其在干旱和生物胁迫下的响应。AlphaFold 3 预测抗体-抗原复合物结构，证实抗体特异性结合 FsPDF2 的不同表位。结果显示 FsPDF2 在生物胁迫（如 gall midge）下显著上调，但干旱胁迫下蛋白水平变化不明显，可能与转录翻译不同步有关。该 ELISA 方法适用于复杂植物样本，为森林早期压力监测提供工具。

植物防御素（Plant Defensins, PDFs）是一类富含半胱氨酸的抗菌肽（Antimicrobial Peptides, AMPs），在植物免疫系统中扮演着重要角色。它们广泛存在于各种植物组织中，但在遭遇环境压力时会显著上调表达。这种特性使得PDFs成为早期诊断森林植物压力反应的理想分子标记。由于PDFs分子量较小（约5千道尔顿），其结构紧凑，因此在检测时需要特定的实验方法和专一的抗体。本研究通过噬菌体展示技术，成功开发了针对正确折叠的beech（欧洲山毛榉，*Fagus sylvatica*）防御素FsPDF2的单克隆重组抗体，并利用AlphaFold 3进行抗体-抗原相互作用的计算机模拟分析。同时，我们还通过实验验证了这些抗体在粗提植物提取物中的应用潜力，首次实现了对天然折叠的防御素进行特异性夹心ELISA检测。该研究方法不仅有助于深入理解植物对各种压力的响应机制，还为未来森林管理提供了重要的工具。

植物在自然环境中面临多种压力，包括干旱、洪水、植食性昆虫的侵害以及病原体感染。作为静态生物，植物无法逃离这些压力，因此必须发展出更有效的免疫系统。森林生态系统尤其容易受到全球气候变化的影响，这种变化导致极端天气事件的频率、持续时间和强度增加，进一步加剧了植物病原体的致病性（Stenlid和Oliva, 2016）。在这样的背景下，PDFs作为潜在的分子标记，具有重要的应用价值。它们不仅参与对病原菌的抗性，还与植物对非生物压力的耐受性有关。例如，大豆中的Dhn8防御素对干旱具有响应，小麦中的Tad1防御素对低温敏感，烟草中的多种防御素对土壤盐度有反应，拟南芥中的PDF1.2对二氧化硫暴露表现出抗性，而*Arabidopsis helleri*中的AhPDF1则在重金属胁迫下被激活（van der Weerden和Anderson, 2013）。

由于转录组和蛋白质组数据在压力响应中的相关性不足，因此在压力响应研究中，进行蛋白质层面的检测显得尤为重要。尽管已有研究尝试使用多克隆抗体检测PDFs，如在马铃薯、烟草和水稻中，但要准确检测结构相似的AMPs，仍需高度特异性的单克隆抗体（Uotila等, 1981）。本研究的目标是建立一个通用的生物技术框架，以实现通过ELISA对AMPs的早期检测，从而为森林管理提供依据。为此，我们选择了山毛榉作为研究对象，因其在生态和经济上都具有重要意义，并且正因气候变化而面临压力。

在实验方法上，我们首先通过计算预测了山毛榉基因组中可能编码防御素及其类似蛋白的基因模型。利用AUGUSTUS-PPX结合植物防御素的氨基酸序列比对，我们识别了80个潜在的防御素样基因位点，其中57个含有信号肽。为了进一步验证这些基因的表达情况，我们从受到不同程度感染的山毛榉叶片中提取了RNA，并构建了四个RNA-Seq文库。结果显示，只有两个预测的防御素样基因在所有样本中表现出相对较高的表达水平，其中CRP01104-12可能是一个表达假基因，而CRP0000-1则与山毛榉基因组中已知的防御素基因FSB0104284重叠。我们将其命名为FsPDF2，作为潜在的压力生物标志物进行进一步研究。

在FsPDF2的重组生产方面，我们采用了一种无杆状病毒的High Five昆虫细胞系统，成功获得了高纯度的重组蛋白。随后，我们通过噬菌体展示技术筛选出针对FsPDF2的单克隆抗体，利用磁珠捕获策略在溶液中进行筛选，以减少传统板式筛选中可能存在的立体障碍效应。通过三轮溶液筛选和一轮固定抗原的筛选，我们最终获得了七个独特的scFv片段，其中两个为λ轻链，五个为κ轻链。这些抗体在ELISA中表现出良好的特异性，其中PHE148-H1和PHE183-B12在压力检测中表现尤为突出。我们还通过AlphaFold 3对抗体-抗原复合物的结构进行了预测，进一步验证了抗体与抗原结合的特异性。结果显示，PHE148-H1主要结合FsPDF2的γ核心结构域，而PHE183-B12则结合α螺旋结构域，这一发现为它们在夹心ELISA中的应用提供了结构基础。

为了验证这些抗体在实际植物样本中的检测能力，我们利用*Agrobacterium tumefaciens*将FsPDF2转入烟草（*Nicotiana benthamiana*）叶片中，以过表达形式进行检测。结果显示，在总蛋白浓度高于10 μg/mL时，FsPDF2可以被成功检测，而在更高浓度下，背景信号增加，可能与植物次生代谢产物的干扰有关。通过使用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）进行提取，我们有效减少了次生代谢产物对ELISA的干扰，提高了检测的准确性。此外，我们还对FsPDF2在不同植物组织中的浓度进行了测定，包括山毛榉胚胎和叶片样本。结果显示，山毛榉胚胎中FsPDF2的浓度在15-50 ng/胚胎之间，而每克新鲜胚胎组织中含量为5-18 μg，表明其在植物防御机制中具有重要作用。

在实际应用方面，我们利用FsPDF2夹心ELISA对自然生态系统中的压力进行了检测。选择干旱作为非生物胁迫的代表，我们从两个位于德国Eberswalde附近的地点采集了山毛榉叶片样本。结果显示，干旱胁迫下的树木的水势显著降低，且FsPDF2的转录水平比对照组高出24倍。然而，在蛋白质层面，我们并未检测到FsPDF2的显著上调，这可能与转录和翻译之间的不完全匹配有关，尤其是在资源匮乏的胁迫条件下，某些蛋白质的表达可能受到限制。此外，我们还检测了由虫瘿中线虫引起的生物胁迫。结果显示，虫瘿组织中的FsPDF2浓度显著高于周围健康叶片组织，表明植物对虫瘿形成具有高度的局部反应。这些发现进一步支持了FsPDF2作为压力标志物的潜力。

在讨论部分，我们强调了抗菌肽（AMPs）在植物防御系统中的重要性。AMPs不仅参与生物胁迫的防御，还在非生物胁迫中发挥关键作用。然而，传统的检测方法如qPCR虽然灵敏度高，但在预测蛋白质丰度方面存在局限。因此，我们需要更精确的检测手段，如ELISA，来实现对AMPs的定量分析。单克隆抗体的使用可以提高检测的特异性，确保在复杂植物样本中准确识别目标蛋白。在本研究中，我们通过噬菌体展示技术获得了针对FsPDF2的高特异性单克隆抗体，这些抗体不仅在ELISA中表现出良好的性能，还通过质谱分析验证了其特异性。此外，我们还发现，尽管存在弱的交叉反应，但这些抗体在山毛榉提取物中仍能保持高度的特异性，表明ELISA方法在实际应用中的可靠性。

为了进一步提升ELISA方法的适用性，我们还对提取过程中可能的干扰因素进行了分析。例如，山毛榉叶片中存在大量鞣质和其他次生代谢产物，这些物质可能影响蛋白质的提取和检测。通过加入PVP，我们有效吸附了这些干扰物质，从而提高了检测的灵敏度和特异性。此外，我们还优化了抗体-抗原结合的条件，确保ELISA在不同植物组织中具有良好的再现性。这一方法为未来在其他植物中研究AMPs提供了可借鉴的框架。

在结论部分，我们总结了本研究的成果和意义。首先，我们成功开发了一种适用于小分子AMPs的检测方法，为植物压力响应研究提供了新的工具。其次，我们验证了FsPDF2作为压力标志物的潜力，特别是在干旱和虫害等胁迫条件下。最后，我们强调了该方法的广泛适用性，不仅可以用于山毛榉，还可以推广到其他植物和AMPs的研究中。通过结合计算生物学和实验技术，我们为未来在复杂植物系统中研究抗菌肽提供了坚实的理论和实践基础。这不仅有助于深入理解植物的防御机制，也为森林管理和农业中的早期压力诊断提供了重要的技术支持。