入侵性水葫芦（Pontederia crassipes Mart.）在温带南欧河流中的时空捕获模式

《Science of The Total Environment》：Spatiotemporal patterns of plastic entrapment by the invasive water hyacinth ( Pontederia crassipes Mart .) in temperate South European Rivers

本研究分析了哈瓦那环境中Leptosphaeria和Alternaria两种真菌孢子的动态，发现两者在雨季（5-10月）浓度最高，且存在显著的昼夜和年际波动。Leptosphaeria夜间浓度更高，而Alternaria白天更活跃。气象因素中，湿度与Leptosphaeria正相关，温度与Alternaria正相关，降雨量对两者均有影响。通过逻辑回归模型，成功建立了Leptosphaeria浓度超过63 spores/m3的预测模型（AUC=0.761），但Alternaria模型的区分度较低（AUC=0.618）。该研究为热带地区过敏原监测提供了新方法，并强调气候因素对真菌孢子扩散的关键作用。

　　### 对哈瓦那空气中Leptosphaeria和Alternaria孢子的气候影响分析

#### 引言

空气中存在各种生物性成分，其中真菌孢子尤为常见，它们的浓度和分布对人类健康具有重要影响。这些微小的生物粒子可以引起过敏反应，如鼻炎和哮喘，已经被多项研究证实（Raphoz et al., 2010；Sidel et al., 2015；Kim et al., 2018；Dey et al., 2019）。因此，分析空气中真菌孢子的组成和浓度对于理解其对过敏人群的影响以及采取预防措施至关重要。

在古巴，真菌多样性的研究涵盖了室内环境和室外环境，尤其是在哈瓦那的都市地区（Almaguer and Rojas, 2013）。在农村地区，研究主要关注空气真菌对作物的潜在危害以及其可能带来的经济损失（Almaguer-Chávez et al., 2012）。Leptosphaeria和Alternaria是古巴大气中最为常见的真菌属，它们主要通过风进行传播。Leptosphaeria的分生孢子在哈瓦那的空气中尤为丰富，而Alternaria的分生孢子在古巴西部的多个研究中被发现具有显著的分布（Almaguer and Rojas, 2013；Almaguer et al., 2014）。

在分类学上，Leptosphaeria和Alternaria都属于Pleosporales目，这一类真菌在环境中广泛存在，既可以作为腐生菌，也可以作为植物和动物的病原体。对这些真菌孢子的过敏性研究显示，它们的敏感性在不同地理区域有所差异。Alternaria被认为是Pleosporales目中最具有过敏性的真菌之一，其包含的过敏原Alt a 1在相关属中高度保守，如Leptosphaeria（Rúa, 2013；De Linares et al., 2022）。全球范围内，Alternaria被公认为主要的空气过敏原之一，与呼吸系统疾病如过敏性鼻炎和哮喘密切相关（Aira et al., 2012；Levetin et al., 2016；Castelló et al., 2020）。它们诱发呼吸道疾病的能力已经被广泛记录（Kasprzyk and Worek, 2006；Grinn-Gofroń and Mika, 2008；Ortega-Rosas et al., 2025）。Leptosphaeria同样与过敏反应相关，特别是在哮喘发作中扮演重要角色（Jedryczka et al., 2016；Kasprzyk et al., 2021）。

在古巴，哮喘和其他过敏性疾病在儿童中尤为常见，然而对环境真菌过敏性的研究仍然有限。已有研究发现，Penicillium、Alternaria和Cladosporium是古巴各地重要的真菌属（Díaz et al., 2010；Bermúdez-Cordoví et al., 2021）。在哈瓦那，对档案灰尘暴露的工作人员显示出较高的Alternaria敏感率（Castelló et al., 2020）。此外，Alternaria在鼻腔微生物群中的存在也与过敏敏感性有关（Barrios et al., 2019）。尽管古巴关于Ascospores的过敏性证据有限，但热带地区如波多黎各的研究表明，Ascospores对过敏个体的影响可能超过Conidia（Rivera-Mariani et al., 2011；Rivera-Mariani and Bola?os-Rosero, 2012）。

预测空气中的孢子浓度是预防过敏危机的关键工具。然而，在热带地区如古巴，由于气象和生物因素的复杂性，可用的预测模型较少（Astray et al., 2010；Chakraborty et al., 2014；Plaza et al., 2025）。在温带地区，如波兰和欧洲，已开发出多种统计模型来预测Alternaria和Leptosphaeria的孢子浓度（Grinn-Gofroń et al., 2019；Dawidziuk et al., 2012a）。这些模型中，温度和湿度等气象变量被识别为预测这些真菌属存在的重要因素（Picornell et al., 2022）。

本研究旨在分析气象变量对哈瓦那空气中Leptosphaeria和Alternaria孢子浓度的影响，采用探索性方法和预测统计模型。这项研究为未来开发适用于热带气候的预测工具奠定了基础，并为减少过敏人群暴露于这些空气过敏原提供了预防策略的参考。

#### 材料与方法

##### 研究区域和空气微生物监测

本研究在哈瓦那进行了为期八年的连续空气孢子监测，从2013年1月1日到2021年12月31日。使用7天体积孢子捕集器（Hirst, 1952）进行采样，该设备安装在哈瓦那大学生物学系建筑的屋顶上，海拔35米。采样过程持续24小时，流速为10升/分钟。由于2020年因新冠疫情防控导致数据采集中断，因此未包含该年的数据。

孢子被收集在涂有2%硅油溶液的Melinex胶带上。每周更换一次鼓筒，将Melinex胶带剪成24小时的片段，并使用甘油和碱性品红混合物进行固定（Galán et al., 2007；Galán et al., 2021）。每个胶带片段在400倍光学显微镜下进行检查，通过形态学特征识别Leptosphaeria和Alternaria孢子，并沿每张载玻片的两个中心纵向进行计数。Leptosphaeria孢子的形态特征包括分隔孢子，无色至浅棕色，纺锤形，光滑，4到9细胞，基细胞扩大，隔膜缢缩，尺寸为10–150 × 5–10 μm。Alternaria孢子则为棱柱状，棕色、浅棕色，形状各异，表面光滑或粗糙，形状为近椭圆形或卵形，尺寸为15–30 × 12–27 μm。

为了评估孢子季节性（Main Spore Season, MSS）的范围，采用了Nilsson和Persson（1981）提出的方法，该方法包括记录90%的季节性孢子总数，从记录5%的孢子总数的日期到记录95%的孢子总数的日期。在MSS期间，使用未受降雨冲刷影响的理想日期计算了日间变化模型（??evková et al., 2019；??evková et al., 2024；Montiel et al., 2025）。

##### 气象数据

哈瓦那的气候通常温暖且潮湿，降雨主要集中在较温暖的月份，温度和降水在年际间有显著波动。一年中分为两个气象季节：干燥季节从11月到4月，雨季从5月到10月（Planos et al., 2013）。气象数据由哈瓦那市的Casablanca气象站记录，该站位于23°09′N和82°20′W，海拔50米，距离生物学系建筑直线距离4.39公里。监测的变量包括最高温度、最低温度和平均温度（°C），最高、最低和平均相对湿度（%），降水量（mm）和风速（km/h）。研究期间观察到气象数据有轻微波动，温度范围在21.0到30.7°C之间，平均温度为25.4°C。相对湿度范围在51.8%到94.3%之间，平均为76.7%。年降雨天数（降水量≥1 mm）在103到127天之间，但年总降雨量变化较大，从2021年的849.7 mm到2013年的2046 mm（表1）。

##### 统计分析

为了比较不同时间段的平均孢子浓度，采用了Mann-Whitney U检验，将白天和夜间进行对比。通过Spearman秩相关检验评估了孢子浓度与气象变量之间的关联强度，p值小于0.05。相关结果通过corrplot包进行可视化。为了评估所有变量对孢子浓度的整体气象影响，进行了主成分分析（PCA）。

开发了多种逻辑回归模型，以预测每种真菌属的浓度是否超过阈值。为此，探索了数据分布并计算了关键百分位数（50%、75%、80%、90%和95%），以定义最合适的二值化阈值，从而将Leptosphaeria和Alternaria的连续浓度变量转换为二元定性变量。模型构建过程分为几个阶段，以确保方法的透明性和可重复性：

1. **初始完整模型（Model T for Leptosphaeria，Model T1 for Alternaria）**：包括了当天的所有气象变量，作为评估预测因子整体贡献的起点。
2. **简化模型（Model A for Leptosphaeria，A2 for Alternaria）**：仅保留初始完整模型中显著的变量，以简化模型结构并提高简约性。
3. **替代模型（Models B, C, D for Leptosphaeria）**：考虑到温度变量之间的中等至高共线性，生成了三个替代模型，每个模型仅包含一个温度变量，同时结合模型A中的显著相对湿度变量。
4. **滞后模型（Models L1–L3 for Leptosphaeria，Models AL–AL2 for Alternaria）**：考虑到天气条件对孢子扩散可能具有延迟效应，应用了LASSO（最小绝对收缩和选择算子）自动选择最多三天前的相关变量。随后，逐步剔除不显著的变量，获得更简单、更容易解释的模型L2–L3和AL1–AL2。

为了评估模型的质量、拟合度和预测能力，应用了多种统计指标。通过似然比检验和Hosmer-Lemeshow检验评估模型对观测数据的拟合度。通过Akaike信息准则（AIC）比较模型的拟合度和复杂度之间的权衡。通过ROC曲线及其曲线下面积（AUC）评估模型的判别能力。此外，生成了混淆矩阵来评估模型的预测，并计算了灵敏度和特异度作为关键的预测性能指标。最佳阈值基于ROC曲线选择，以实现灵敏度和特异度之间的最佳平衡。灵敏度指的是观察到的阳性样本中真正阳性的百分比，而特异度指的是观察到的阴性样本中真正阴性的百分比（De Linares et al., 2010）。所有情况都验证了方差膨胀因子（VIF），以量化多重共线性的强度。

#### 结果

在研究期间，收集的数据表明，两种孢子类型的浓度存在显著的年际变化。Leptosphaeria的年总孢子数范围从7290到57,230 spore * day/m3，而Alternaria的年总孢子数范围从54到854 spore * day/m3。在2013年，Leptosphaeria的日均浓度被超过的天数为100天（占全年27.4%），而在2017年为118天（占全年32.3%）。日间最大浓度在170到2511 spores/m3之间，主要集中在雨季（5月至10月）。相比之下，Alternaria的日均浓度被超过的天数在2021年为28天（占全年7.7%），而在2015年为264天（占全年72.3%）。日间最大浓度在8到77 spores/m3之间，同样在雨季达到高峰（表1）。

在分析整个时间序列的日均浓度时，观察到两种孢子类型存在不同的分布模式（图2a-b）。Leptosphaeria的浓度在5月开始上升，在6月、8月、9月和11月达到高峰。Alternaria的浓度在3月至7月之间较高，这一趋势也反映在月均浓度中。

在研究期间，两种孢子类型的MSS都较为广泛，每年大部分时间都存在（图2c）。从2013年至2021年，MSS的持续时间存在差异，最高概率的空气存在时间为4月下旬至8月中旬。在MSS期间，两种真菌属的孢子在全天检测到，但存在不同的日内分布模式（图3）。每年，Leptosphaeria在清晨或黎明时分占主导地位，而Alternaria在大多数年份中显示出日间分布。总体的日内分布（2013–2021）显示，Leptosphaeria在夜间（3–6小时）占主导地位，而Alternaria在白天（11–14小时）占主导地位。根据Mann-Whitney U检验，Leptosphaeria和Alternaria的白天值与夜间值存在显著差异。

关于气象参数，当天的风速是唯一与Leptosphaeria存在无关联的变量。大多数相关性为正，除了风速在前几天。Alternaria则与当天的平均温度、过去一天、两天和三天的最高温度以及当天和过去一天的最高相对湿度呈正相关。最低相对湿度（当天、过去一天、两天和三天）以及平均相对湿度（当天）和风速（当天、过去一天、两天和三天）与Alternaria呈负相关（图4，图S1）。

通过PCA分析，使用了Spearman rho值大于0.2的Leptosphaeria变量和大于等于0.1、小于等于-0.1的Alternaria变量，以最小化非显著结果并确保有意义的主成分。提取了两个主成分，代表了原始数据中约58%的变异（图5）。

这项分析显示，平均相对湿度（当天、过去一天和两天）以及最高相对湿度（当天和过去一天）与Leptosphaeria浓度在多变量空间中存在变化模式。对于Alternaria，最高温度（当天）是主要因素。通过探索Leptosphaeria和Alternaria浓度数据，发现它们高度右偏（许多低值，少数极高值）且存在异常值（图S2）。因此，选择75%分位数（Q3 = 63 spores/m3 for Leptosphaeria和1 spore/m3 for Alternaria）作为阈值，这是合理的标准，可以避免极端值对结果的负面影响（表S1）。该阈值识别了浓度最高的25%，作为二元模型的少数类，有助于二元预测模型的构建。如果浓度高于该分位数，则赋予“1”，否则赋予“0”。所有测试的逻辑回归模型都比空模型拟合得更好，表明所包含的解释变量和模型本身具有显著性（似然比检验）（表2，表S2）。

对于Leptosphaeria，初始完整模型（Model T）包含了当天的所有气象变量，但剔除不显著的预测因子后得到简化模型（Model A）。然而，在此模型中，最高温度、平均温度和最低温度之间存在中等至高的共线性。为了确保更简约，生成了三个替代模型（Models B, C, D），每个模型仅包含一个温度变量，同时结合Model A中的显著相对湿度变量。对于滞后模型，Model L1逐步简化，剔除不显著的预测因子，最终得到更简单、更容易解释的Model L2和L3。比较这些模型（所有变量均显著且共线性较低至中等）显示，Model L3是最合适的，因为它在预测性能、简约性和统计有效性之间提供了良好的平衡（表2，表S2-S3）。AUC表明该模型具有良好的判别能力；灵敏度64.7%和特异度75.6%代表了在检测高浓度日和避免假阳性之间的一个合理平衡。此外，Hosmer-Lemeshow检验的p值表明模型对观测数据的拟合度良好，而较低的AIC表明模型在拟合度和复杂度之间取得了最佳平衡。因此，可以得出结论，Leptosphaeria浓度高于63 spores/m3的概率可以通过温度、相对湿度和降雨来预测。过去一天的最低温度、当天的最高温度、当天和过去一天的相对湿度以及过去两天的降雨量均有助于其存在的概率。相反，当天的平均温度、过去两天的最高温度以及过去一天的最低相对湿度则降低了其存在的概率。

对于Alternaria，使用当天变量的完整模型（Model T1）逐步简化以获得Model A2（表2，表S2和表S4）。同样，使用AL1滞后变量的模型（通过LASSO选择）逐步简化以得到AL2模型。比较这些模型A2和AL2显示，Model A2具有更好的拟合度（更低的AIC），略有改善的判别能力（AUC），并提高了特异度而不牺牲太多灵敏度。Hosmer-Lemeshow检验的p值表明模型对观测数据的拟合度更为合适。然而，AUC接近0.62，表明其判别能力有限。尽管如此，这些结果表明，平均温度的增加和过去一天最低相对湿度的增加都会影响Alternaria存在的概率。每天平均温度每增加1°C，其存在的概率增加，而过去一天最低相对湿度每增加1%，其存在的概率降低。这一模式表明，尽管最高温度在PCA中对Alternaria的变异具有结构性关系，但平均温度和最低相对湿度在解释存在概率方面具有更大的作用。这可能是因为平均温度更好地反映了Alternaria的发育条件，而不是极端值。此外，一些作者指出，Alternaria孢子的时空变化在适度温暖的温度下更为有利，而高相对湿度则倾向于抑制其释放和扩散（Olsen et al., 2020；De Linares et al., 2022；Gharbi et al., 2022；Plaza et al., 2025）。

逻辑回归是一种广泛用于基于存在/缺失数据的物种分布预测模型的工具，因其能够估计二元结果的概率（Real et al., 2006）。它在估计空气孢子浓度超过阈值的准确性方面也得到了验证（Vélez-Pereira et al., 2023）。在本研究中，它使我们能够开发出一个具有生物学意义的预测模型，用于检测超过63 spores/m3的Leptosphaeria浓度。灵敏度和特异度值表明，该模型在检测高孢子天数方面表现良好，同时减少了假阳性。尽管没有针对Leptosphaeria的特定阈值与呼吸道症状相关，但所使用的分类标准在统计上是合理的，用于识别最高暴露天数。以往的研究已经使用了针对Alternaria的定义阈值，因为它们与Leptosphaeria共享同源过敏原序列；然而，这些临床值（80–300 spores/m3）远高于本研究中观察到的值，支持了需要适应数据分布的阈值标准（Kasprzyk et al., 2015；Jedryczka et al., 2016）。这些发现支持了其作为呼吸道过敏症早期预警系统的潜在基础，并作为古巴地区综合健康决策工具的一部分。

尽管模型的预测性能良好，但需要注意的是，由于数据来自同一地点，孢子浓度可能存在时间自相关性。这一缺点在一定程度上被将因变量转换为二元度量（≥75%分位数 vs. <75%分位数）以及样本量所缓解。需要指出的是，本研究的目标并非使用时间序列模型预测每日浓度，而是开发一个探索性逻辑模型，用于估计高浓度事件的概率并识别相关气象条件。因此，该模型并不旨在取代先进的预测方法，而是提供一个初步的框架，描述生态关系。此外，它还可以作为未来开发更复杂的时间预测模型的基础，这些模型可以纳入考虑时间结构的方法。

相比之下，Alternaria的模型显示出清晰的解释结构和合理的统计拟合，但其预测性能有限，这可能归因于高浓度天数较少。目前，该模型的主要价值在于解释性。持续的空气微生物监测将有助于扩大数据库，从而增强其预测能力。尽管在哈瓦那，Alternaria的浓度很少超过常见的敏感阈值，但最近的研究报告了即使在较低浓度下也出现过敏症状（Rodríguez-Fernández et al., 2024）。因此，监测Alternaria仍然重要，尤其是在敏感人群和气候变化背景下。

#### 讨论

本研究分析了Leptosphaeria和Alternaria孢子在哈瓦那的空气微生物行为，并将其与环境变量联系起来。两种属广泛分布，包含可能存在于各种基质、土壤中的物种，作为腐生菌或多种植物的病原菌（Camino et al., 2006）。它们的检测对于过敏学具有重要意义，因为Leptosphaeria基因组中已发现与Alternaria的Alt a 1过敏原同源的序列，显示出高度的相似性（Chruszcz et al., 2012）。因此，过敏人群中可能存在交叉反应。

Leptosphaeria在哈瓦那的高流行性已被先前研究记录（Almaguer et al., 2014），并且与印度或巴基斯坦等温暖地区的高浓度类似（Das and Gupta-Bhattacharya, 2008；Hasnain et al., 2012）。在西班牙的Mérida、Badajoz和Barcelona等地，Leptosphaeria的浓度在夏季和初秋达到高峰（Mu?oz et al., 2010；Fernández-Rodríguez et al., 2015；Rúa, 2013）。它也可以在葡萄牙、意大利和希腊发现，但浓度较低（Gonianakis et al., 2006；Oliveira et al., 2009；Magyar et al., 2009；Oliveira et al., 2010a；Oliveira et al., 2010b）。在澳大利亚，它是大气中的重要组成部分（Mitakakis and Guest, 2001；Stennett and Beggs, 2004）。

在古巴，Alternaria的浓度在3月至7月之间较高。在北美，Alternaria孢子在夏季或初秋达到高峰（Bush and Prochnau, 2004；Rocha et al., 2013），而在智利则在春季和秋季（Ibá?ez et al., 2001）。在热带印度，最高浓度出现在6月（Das and Gupta-Bhattacharya, 2008）。在欧洲，季节性模式可能显示全年多个浓度高峰（Rizzi-Longo et al., 2009；Aira et al., 2013；Kasprzyk et al., 2013）。在西班牙的巴塞罗那，Alternaria的浓度在3月至7月之间较高，而在马拉加则全年保持稳定（Recio et al., 2012）。在葡萄牙，它从春季持续到冬季，夏季浓度较高，与英国类似（Corden and Millington, 2001；Oliveira et al., 2010a）。

逻辑回归是一种广泛用于基于存在/缺失数据的物种分布预测模型的工具，因为它能够估计二元结果的概率（Real et al., 2006）。它在估计空气孢子浓度超过阈值方面也证明了其准确性（Vélez-Pereira et al., 2023）。在本研究中，它使我们能够开发出一个具有生物学意义的预测模型，用于检测超过63 spores/m3的Leptosphaeria浓度。灵敏度和特异度值表明，该模型在检测高孢子天数方面表现良好，同时减少了假阳性。尽管没有针对Leptosphaeria的特定阈值与呼吸道症状相关，但所使用的分类标准在统计上是合理的，用于识别最高暴露天数。以往的研究已经使用了针对Alternaria的定义阈值，因为它们与Leptosphaeria共享同源过敏原序列；然而，这些临床值（80–300 spores/m3）远高于本研究中观察到的值，支持了需要适应数据分布的阈值标准（Kasprzyk et al., 2015；Jedryczka et al., 2016）。这些发现支持了其作为呼吸道过敏症早期预警系统的潜在基础，并作为古巴地区综合健康决策工具的一部分。

然而，该模型的一个局限性在于，孢子浓度可能存在时间自相关性，因为数据来自同一地点。这一缺点在一定程度上被将因变量转换为二元度量（≥75%分位数 vs. <75%分位数）以及样本量所缓解。需要指出的是，本研究的目标并非使用时间序列模型预测每日浓度，而是开发一个探索性逻辑模型，用于估计高浓度事件的概率并识别相关气象条件。因此，该模型并不旨在取代先进的预测方法，而是提供一个初步的框架，描述生态关系。此外，它还可以作为未来开发更复杂的时间预测模型的基础，这些模型可以纳入考虑时间结构的方法。

相比之下，Alternaria的模型显示出清晰的解释结构和合理的统计拟合，但其预测性能有限，这可能归因于高浓度天数较少。目前，该模型的主要价值在于解释性。持续的空气微生物监测将有助于扩大数据库，从而增强其预测能力。尽管在哈瓦那，Alternaria的浓度很少超过常见的敏感阈值，但最近的研究报告了即使在较低浓度下也出现过敏症状（Rodríguez-Fernández et al., 2024）。因此，监测Alternaria仍然重要，尤其是在敏感人群和气候变化背景下。

#### 结论

本研究的结果突显了Leptosphaeria和Alternaria在哈瓦那空气中复杂的生态动态，这种动态强烈受到气象变量如温度、相对湿度和降水的影响。两种孢子类型在全年中显示出较长的出现时间，尤其是在4月至8月之间，这一时期也是最温暖和最潮湿的月份。小时模式表明，Leptosphaeria孢子在清晨或黎明时分释放，而Alternaria孢子则在白天释放。Leptosphaeria孢子与相对湿度和前三天的降水量相关，而Alternaria则与温度呈正相关，与最低相对湿度呈负相关。仅有一种预测模型用于Leptosphaeria，该模型能够检测到超过63 spores/m3的浓度，其指标表明在统计和实际性能上都表现良好。尽管没有明确的阈值与呼吸道症状相关，但所使用的分类标准在统计上是合理的，用于识别最高暴露天数。Leptosphaeria和Alternaria的长期暴露，即使没有超过临界阈值，也可能对过敏人群构成潜在风险，强调了在热带地区继续开发这些孢子的预测模型的必要性。在热带背景下实施监测系统和预测模型对于改善呼吸道疾病的管理以及减轻对公共卫生的威胁至关重要。