通过模块化分子工程在大肠杆菌中高效生产维生素K2

《Taiwanese Journal of Obstetrics and Gynecology》：High-level production of vitamin K2 in Escherichia coli via modular molecular engineering

通过整合代谢重排、酶理性设计和表达优化策略，本研究显著提高了大肠杆菌中维生素K2（MK-7）的合成效率。敲除竞争途径基因并过表达关键酶，结合AI辅助的理性设计使EcMenA酶活性提升57.2%，再通过随机突变获得G110W-Q57T双突变体，摇瓶发酵产率达227.53 mg/L。最终在50 L生物反应器中实现2.18 g/L的高产，验证了系统化工程框架的有效性。

　　维生素K2是一种重要的脂溶性营养素，其多种同系物中，甲萘醌-7（MK-7）因其显著的生物活性和健康效益而受到广泛关注。MK-7在钙代谢调控和凝血功能维持方面发挥核心作用，能够通过激活骨钙素（OC）和基质Gla蛋白（MGP）来增强骨骼强度并防止骨质疏松症。同时，它还能抑制血管壁上的钙沉积，从而降低动脉粥样硬化的风险。鉴于其在人体健康中的重要作用，MK-7在制药和营养补充领域展现出巨大的商业潜力，其市场价值也持续增长。根据2024年的市场报告，维生素K2的全球市场价值约为2.034亿美元，预计到2034年将超过7.087亿美元，这表明MK-7的生产需求正在迅速上升。

传统的MK-7生产方法包括植物提取、化学合成和微生物发酵。虽然植物提取和化学合成能够提供一定量的MK-7，但这些方法存在成本高、环境影响大以及产品纯度难以控制等问题。相比之下，微生物发酵具有更高的可操作性和可持续性，因此成为近年来研究的重点。在众多微生物中，枯草芽孢杆菌（*Bacillus subtilis*）和大肠杆菌（*Escherichia coli*）是最常被用于MK-7生产的菌株。然而，枯草芽孢杆菌的发酵周期较长，通常需要超过100小时才能完成，而大肠杆菌因其遗传操作的便利性和较短的发酵时间（通常小于50小时）成为更优的选择。此外，大肠杆菌在厌氧条件下天然能够合成三种醌类物质：泛醌-8（Q-8）、甲萘醌-8（MK-8）和去甲基甲萘醌-8（DMK-8），其中MK-8是主要产物。由于缺乏七异戊二烯基焦磷酸合成酶（HepPPS），大肠杆菌无法合成MK-7。因此，研究人员致力于通过基因工程手段，将HepPPS等关键基因引入大肠杆菌，从而实现MK-7的合成。

本研究提出了一种整合模块化代谢工程策略，旨在提高MK-7的生物合成效率。首先，通过对细胞膜容量和乙酸代谢路径的重构，研究人员优化了前体供应，为甲羟戊酸（MVA）途径提供了充足的底物。其次，通过阿拉伯糖诱导系统，过表达了三种关键酶：来自枯草芽孢杆菌的HepPPS（BsHepPPS）、来自大肠杆菌的MenA（EcMenA）以及来自枯草芽孢杆菌的UbiE（BsUbiE）。其中，EcMenA被鉴定为合成MK-7过程中的主要瓶颈。为此，研究人员基于折叠自由能分析和共识设计方法，对EcMenA进行了理性蛋白工程，获得了G110W突变体，该突变体在摇瓶发酵中实现了102.55 mg/L的MK-7产量，比野生型（WT）提高了57.21%。进一步的活性位点热点随机诱变实验生成了G110W-Q57T双突变体，使得MK-7产量提升至176.38 mg/L，比单突变体提高了72%。此外，通过利用生成网络对EcMenA表达载体中的核糖体结合位点（RBS）进行重新设计，MK-7产量进一步提高至227.53 mg/L。最终，在50升生物反应器中进行放大发酵，并结合优化的发酵策略，成功实现了2.18 g/L的MK-7产量，这是目前报道的最高水平之一。

MK-7的合成涉及两个主要代谢途径：甲基赤藓醇磷酸（MEP）途径和1,4-二氢萘醌（DHNA）途径。MEP途径负责合成异戊烯基焦磷酸（IPP），而DHNA途径则生成DHNA。研究人员通过整合异源MVA途径并优化DHNA的供应，确保了前体的充足。此外，为了减少竞争代谢路径的干扰，研究人员对*nlpI*和*poxB*基因进行了敲除，以提高细胞膜的稳定性和减少乙酸的积累。同时，通过过表达乙酰辅酶A合成酶（*acs*）来增加细胞内乙酰辅酶A的可用性，进一步优化了MVA途径的效率。这些策略共同构成了一个系统性的工程框架，不仅提升了MK-7的产量，也为工业规模的微生物合成提供了坚实的基础。

在实验过程中，研究人员采用了多种基因工程策略。首先，通过CRISPR-Cas9技术对*nlpI*和*poxB*基因进行敲除，从而减少乙酸的积累并增强细胞膜对MK-7的储存能力。其次，利用高通量筛选技术对EcMenA进行随机突变，以寻找具有更高催化活性的变体。通过结构和AI驱动的活性位点预测工具PrankWeb，研究人员识别出多个关键残基，并通过饱和突变筛选出具有显著提升MK-7产量的突变体。此外，为了进一步优化EcMenA的表达，研究人员利用AI算法设计了新的RBS序列，并筛选出其中最有效的变体，将其整合到表达载体中，从而显著提高了MK-7的产量。

在发酵过程中，研究人员采用了一种优化的分批补料策略，以确保营养物质的持续供应并维持代谢稳定性。发酵开始时，细胞在37°C下快速生长，随后在OD600达到70时，通过添加阿拉伯糖诱导关键酶的表达，并将温度降至30°C以减少代谢负担。在诱导12小时后，温度再次升至37°C，以促进MK-7的合成。在整个过程中，pH值被严格控制在7.0，以维持最佳的酶活性和细胞生长条件。此外，通过动态调节葡萄糖的补料速率，研究人员能够有效控制代谢流，从而最大化MK-7的产量。

分子动力学（MD）模拟进一步揭示了EcMenA突变体在结构稳定性方面的优势。与野生型相比，G110W-Q57T突变体表现出更低的RMSD值，表明其结构更加稳定。同时，RMSF分析显示，突变体在活性位点附近的残基运动性显著降低，这有助于形成更稳定的氢键网络，从而提高酶的催化效率。此外，突变体中活性位点附近的空间距离显著缩短，如D68与D208之间的距离从8.2 ?降至6.0 ?，这可能增强了酶对底物的结合能力，并优化了催化过程的动态平衡。这些结构变化不仅提高了酶的稳定性，还增强了其催化活性，从而推动了MK-7的高效合成。

本研究的成果不仅体现在MK-7产量的显著提升，还为微生物合成天然代谢产物提供了新的思路。通过整合代谢路径优化、酶工程和表达调控，研究人员构建了一个高效的合成系统，能够满足工业生产的需求。此外，该研究还强调了理性设计与人工智能辅助预测在酶工程中的重要性，为未来在其他高价值产品的合成中提供了可借鉴的方法。尽管目前的工程策略已经取得了显著进展，但仍然存在一些挑战，例如红ox辅因子的平衡问题和前体路径的动态调控需求。未来的研究将进一步优化这些方面，以实现更高效、更稳定的MK-7生产，并探索其在更大规模生物反应器中的应用潜力。

总之，本研究通过系统性的代谢工程和酶进化策略，显著提升了MK-7的产量。研究人员不仅确认了EcMenA作为关键瓶颈的重要性，还通过结构导向的突变设计和表达载体优化，成功实现了高产量的MK-7合成。这些成果为维生素K2及其相关高价值产品的微生物合成提供了坚实的理论和技术基础，同时也为合成生物学领域的发展提供了新的方向。未来，随着基因工程和人工智能技术的不断进步，MK-7的生产效率和产量有望进一步提高，从而推动其在制药和营养补充领域的广泛应用。