宿主细胞与病原体相互作用过程中，营养缺乏与抗生素引起的营养耗竭之间的恶性循环：辅酶Q10和欧米伽-6作为关键的分子参与者

《Tissue and Cell》：The vicious cycle between nutrient deficiencies and antibiotic-induced nutrient depletion at the host cell-pathogen interface: Coenzyme Q10 and omega-6 as key molecular players

抗生素诱导的肠道-肝脏轴炎症中，联合使用抗生素（左氧氟沙星）和益生菌（乳酸杆菌）可减轻病原体（铜绿假单胞菌）引起的细胞损伤，改善肠道屏障功能，并通过调节Th1/Th2细胞因子平衡（如IL-1β、IL-6、IL-10）抑制病理炎症。研究显示，益生菌通过补充Omega-6脂肪酸（如亚油酸）和辅酶Q10增强宿主抗氧化能力，但抗生素可能轻微抑制益生菌活性，导致协同效应有限。

　　在当今医学领域，抗生素耐药性和病理炎症的日益严重，凸显了理解宿主-病原体界面下基础生化和免疫过程的重要性。营养缺乏与抗生素引起的营养消耗形成一个恶性循环，导致明显的炎症反应，进一步加剧细菌毒素在人体器官之间和内部环境的转移。辅酶Q10（CoQ10）和ω-6亚油酸（LA 18:2ω6）在细胞膜完整性和免疫防御中起着关键作用。然而，目前对宿主细胞与病原体之间的复杂酶促过程仍然了解有限。这项研究尤其具有现实意义，因为它探索了这些知识空白，这可以为开发调节或靶向这些机制的营养和治疗策略提供信息。通过构建肠道-肝脏轴的感染-炎症细胞共培养模型，我们对人类肠道上皮细胞（T84）、类似巨噬细胞的THP-1细胞和肝细胞（Huh7）进行了三细胞共培养实验，这些细胞暴露于产生亚油酸的乳酸杆菌（L. casei）和假单胞菌株PAO1（PAO1）。在含有或不含头孢他啶抗生素的培养基中培养6小时后，PAO1和L. casei对Th1细胞因子IL-1β、IL-6以及Th2型细胞因子IL-10的分泌产生了相反的影响。与未感染对照组相比，PAO1的接种显著降低了CoQ10和亚油酸的水平。L. casei则恢复了PAO1引起的细胞健康和生物功能的损害，表明其对宿主健康有益。头孢他啶抗生素表现出双重作用，缓解了PAO1的毒性，同时对L. casei的有益作用产生了轻微干扰。我们的研究结果表明，营养缺乏和抗生素引起的营养流失的恶性循环如何在宿主细胞-病原体界面强化病理炎症，并强调了需要更合适的抗生素使用，以保护如CoQ10和ω-6脂肪酸等关键营养素。由机会性病原体和产生亚油酸的细菌驱动的炎症反应代表了相互对立的免疫代谢途径，这些途径可能为治疗感染和减少抗生素耐药性的新方法提供见解。

### 1. 引言

营养缺乏和抗生素诱导的营养消耗可以形成一种自我强化的炎症循环，这种循环有助于细菌毒素信号分子在人体器官之间和内部环境的转移。这一相互作用在肠道-肝脏轴中尤为重要，因为宿主的营养状态、微生物活动和免疫反应在此处交汇。在此背景下，理解关键营养素如何与抗生素治疗和宿主-病原体动态相互作用，对于开发更精确的治疗策略至关重要。研究指出，辅酶Q10是一种类似于维生素的脂溶性分子，位于细胞膜和线粒体中，它在线粒体电子传递和抗氧化防御中起着关键作用。由于其生物能量和抗炎特性，辅酶Q10在临床营养中被广泛使用，尤其是在氧化应激和线粒体功能障碍的条件下。亚油酸（LA）是ω-6多不饱和脂肪酸（PUFAs）的母体化合物，是人体无法从头开始合成的必需脂肪酸。它必须通过饮食来源或肠道共生微生物如双歧杆菌和乳酸杆菌来获得。LA及其下游代谢物参与免疫调节、膜结构和脂质信号传导。特别是，LA和辅酶Q10都是细胞膜的重要组成部分，参与维持屏障完整性和免疫稳态。最近的研究表明，细菌病原体利用宿主来源的脂质来支持其生长和毒力。例如，假单胞菌可以劫持宿主脂肪酸，包括由LA衍生的花生四烯酸，来调节宿主免疫反应。此外，n-6 PUFAs，如LA，已被证明可以增强某些抗生素对病原菌的疗效。

尽管历史上ω-6脂肪酸被贴上促炎标签，但新的证据重新评估了这一观点。虽然LA是促炎性二十烷酸的前体，但临床研究显示，健康成年人的高LA摄入并不一定增加炎症标志物。事实上，LA与抗炎效应和心血管风险及2型糖尿病的减少有关。这些发现强调了ω-6脂肪酸在免疫调节中的双重作用，参与炎症的启动和解决。抗生素治疗虽然在管理感染方面至关重要，但可以显著扰乱肠道微生物群，影响消化，并改变宿主代谢。通过影响微生物发酵和蛋白质消化，抗生素可能导致宏量和微量营养素的缺乏。此外，抗生素已被显示对宿主细胞产生直接影响，包括线粒体功能障碍和宿主代谢组谱的变化，而不论微生物的变化如何。尽管对微生物-营养素-药物三元组的兴趣日益增加，但目前对宿主-病原体界面下抗生素如何影响CoQ10和ω-6脂肪酸的相互作用仍知之甚少。新兴证据表明，CoQ10和LA可能形成分子间相互作用，促进膜通透性和营养物质运输，可能影响药物输送和免疫反应。然而，在感染或炎症的宿主环境中，它们在抗生素压力下的综合行为尚未得到充分研究。因此，主要的研究空白是：之前没有研究探讨在抗生素暴露时，是否需要同时补充CoQ10和ω-6 LA以维持宿主-病原体界面下的健康。抗生素如何在炎症条件下调节这一营养相互作用的机制仍不清楚。为了解决这一空白，我们使用了包含肠道上皮细胞、巨噬细胞和肝细胞的三细胞共培养模型，这些细胞类型共同代表了肠道-肝脏轴。该模型允许我们在感染和抗生素治疗期间模拟肠道屏障、免疫反应和肝脏代谢之间的生理相互作用。在这一模型中，肠道上皮细胞作为对抗病原体的第一道屏障，对于营养吸收和黏膜免疫至关重要。巨噬细胞是先天免疫的关键参与者，协调炎症反应并维持组织稳态。肝细胞是肝脏的主要功能细胞，调节全身代谢，解毒外源性物质，并直接响应微生物信号。这些细胞之间的相互关联对于理解感染期间肠道-肝脏轴的功能障碍至关重要。此外，不同的细胞类型在代谢LA和对CoQ10的反应上表现出不同的能力，这使得该模型成为在多个层面研究营养-抗生素相互作用的理想选择。因此，我们假设营养缺乏和抗生素引起的营养消耗促进了由肠道细胞和肝细胞之间的Th1/Th2细胞因子信号介导的病理炎症恶性循环。这种循环有助于有毒细菌信号的转移，并加剧宿主-病原体界面的炎症。此外，我们假设同时补充CoQ10和LA可以缓解这些影响。为此，我们研究了头孢他啶这种广谱抗生素对这种体外感染-炎症模型中营养信号和炎症的影响，无论是在CoQ10和ω-6补充存在还是不存在的情况下。这项研究与之前提到的出色研究有所不同，这些研究主要关注抗生素对细菌耐药性或宿主营养吸收的影响。相反，我们采用了一种体外感染-炎症三细胞共培养模型，直接研究病理炎症（而非生理炎症）、与营养相关的生物标志物（如CoQ10和ω-6）以及Th1/Th2细胞因子反应之间的相互作用。这种控制系统使我们能够从机制上评估由抗生素、营养素和宿主-病原体相互作用形成的复杂三元组如何调节宿主细胞代谢和免疫信号，这一领域在之前的研究中几乎没有被探索过。通过将微生物、免疫学和营养学轴联系起来，这项研究提供了一个整合性的视角，这在之前的研究中并不常见。此外，这项研究提供了关于不当使用抗生素与营养紊乱相关病理生理学的新见解，并突出了基于营养素的干预在保持宿主防御机制方面的营养和治疗潜力。

### 2. 材料与方法

#### 2.1. 试剂和试剂盒

高级DMEM（Gibco，Cat. #12491015）、一次性无菌小型细胞刮刀（Cat. #NC0325221，设计用于96孔板的均匀使用）、Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水（DPBS，Gibco，Cat. #14190250）、胎牛血清（FBS，Gibco，Cat. #A5670701）和Transwell插入件（0.4-μm孔径，24-mm直径）在Transwell培养中使用，均购自Fisher Scientific GmbH（Schwerte，德国）。人类IL-1β（Cat. #900-K95）、IL-6（Cat. #900-K16）、IL-10和TNF-α的ELISA试剂盒购自PeproTech（Hamburg，德国）。人类辅酶Q10 ELISA试剂盒（Cat. #ABIN6975185）购自antibodies-online GmbH（Aachen，德国）。头孢他啶（Cat. #CDS020667）和佛波醇-12-肉桂酸-13-醋酸盐（PMA，Sigma Cat. #P8931）从Sigma Chemical（Sigma-Aldrich，Taufkirchen，德国）获得。

#### 2.2. 文献检索

为了支持三细胞体外共培养模型的开发和实验设计，并确认细菌株和抗生素治疗的选择，使用PubMed、Ebsco、Google Scholar和Science Direct进行了定向文献检索。检索策略结合了本研究的主要关键词，包括抗生素诱导的炎症、抗生素诱导的微生物失调、肠道-肝脏轴、肠道免疫肝细胞共培养、细菌转移、体外宿主-微生物相互作用、metaflammation、感染和细胞因子。相关研究被回顾以确定实验条件、共培养系统和微生物群模型。我们排除了编辑信、历史综述和未发表数据的分析。未应用特定日期限制。

#### 2.3. 细菌株和培养条件

作为产生亚油酸的天然细菌株（Peng et al., 2018）和机会性病原体模型细菌（Wood et al., 2023），分别使用了革兰氏阳性乳酸杆菌株（L. casei，ATCC 334）和革兰氏阴性假单胞菌株PAO1（PAO1，DSM 22644）。

在革兰氏阴性机会性人类病原体中，假单胞菌作为肠道中的食物源性病原体的风险可以总结如下：最近的研究报告了多药耐药（MDR）假单胞菌在食品中的显著污染，其全球传播对公共健康构成严重威胁。假单胞菌导致显著的组织损伤，并且高度耐受抗生素，这可能导致人类和动物中的致命感染。这种病原体在各种食品组中已被检测到，并且由于其快速增殖、形成生物膜的能力以及携带这种物种常见的内在和获得性抗菌药物抗性基因（ARGs），治疗起来特别困难。此外，抗生素对肠道微生物群的破坏（微生物失调）促进了MDR假单胞菌在肠道中的定植。其迅速出现和传播继续威胁公共健康和食品安全。

PAO1和L. casei的培养方法及其在本研究中的使用之前已被详细描述（Ghadimi et al., 2023；Li et al., 2023；Ramsay et al., 2023；Uchiyama et al., 2016）。为了常规维护和计数PAO1细菌培养，通过将菌株在0.09% B. Braun等渗盐水中稀释、在LB琼脂上接种，并在37°C下培养48小时，获得细菌计数（每毫升菌落形成单位，CFU/ml）。为了准备用于三个独立实验的活性和同步细菌悬液，并确保在与真核宿主细胞共培养前的存活率，PAO1细菌菌落保存在4°C。在每次实验前，将单菌落接种到含有5毫升LB肉汤的试管中，并在37°C下温和摇动（120转/分钟）培养过夜。然后通过离心（4000转/分钟，5分钟，4°C）收集细菌，用DPBS洗涤两次，并重悬于新鲜的DPBS中。悬液通过1000 μl Eppendorf Vis Cuvette在EPPENDORF生物光度计上调整（600 nm的光密度为0.2），这对应于约2×10^9 CFU/ml的细菌浓度，称为原始细菌培养。原始细菌培养通过顶点处理混合，并将50 μl细菌悬液加入含有T84单层细胞的指定插入件内侧。

L. casei ATCC-334（L. casei），一种已知能产生亚油酸的天然细菌模型（Peng et al., 2018），从美国类型培养物收集（ATCC，LGC Standards GmbH，Wesel，德国）获得。为了常规维护，L. casei培养物在37°C下使用MRS肉汤在斜面上培养。为了细菌计数，过夜培养在37°C下在厌氧工作站（A45；Don Whitley Scientific，Bingley，UK）中进行厌氧培养。培养后，通过在MRS肉汤中进行系列稀释并接种到琼脂板上，确定菌落形成单位（CFU）。然后在厌氧条件下培养48小时，再进行菌落计数。为了与真核宿主细胞共培养，L. casei的准备遵循与PAO1相同的协议，但L. casei在厌氧条件下培养。用于PAO1和L. casei的细菌与宿主细胞的比率均为1.7:1（CFU与宿主T84细胞），如“炎症共培养模型”部分所述。这个比率的选择是因为在人体中，细菌与人类细胞的比率估计为大约1:1–1.618。

#### 2.4. 细胞培养维护

人类肠道上皮T84细胞系从美国类型培养物收集（ATCC CCL-248，LGC Standards GmbH，Wesel，德国）获得。细胞（传代数19–23）在T-75细胞培养瓶中使用高级Dulbecco’s改良Eagle培养基（Advanced DMEM）培养，补充5%（v/v）胎牛血清。为了形成极化单层，细胞在适当数量的重复插入件中以每孔2.4×10^5个细胞的密度接种在Transwell插入件（0.4-μm孔径，24 mm直径；Corning，Cat. #3450）的膜上，并培养7–8天。培养基每2–3天更换一次，上室加入1.5毫升，下室加入2.6毫升（最终体积）。

紧密连接的形成功能通过测量跨上皮电阻力（TEER）来评估。使用epithelial volt-ohmmeter（Millicell ERS-2，Merck Millipore，Darmstadt，德国）按照制造商说明测量TEER。未感染的单层的电阻力范围为600到700 Ω × cm2，减去细胞自由滤器的电阻力后得到。当细胞达到90%以上汇合时，它们被用于实验。

Huh7人肝细胞（来自我们保存在液氮中的冷冻细胞库存）来自日本研究生物源细胞库（JCRB0403 HuH-7；FUJIFILM Wako Chemicals Europe GmbH，Neuss，德国）。细胞在标准DMEM培养基中培养，补充5% FBS和1%非必需氨基酸，如前所述详细描述（Ghadimi et al., 2024）。细胞在约80%汇合时常规传代，并在解冻后传代18–24次使用。

对于上皮和肝细胞系，培养基每2–3天更换一次。一旦细胞达到80–90%汇合，它们用DPBS洗涤，并用TrypLE Express酶在37°C下处理5分钟。酶反应通过加入完全培养基中和，然后离心并分装到新的细胞培养瓶中进行传代。

THP-1细胞系（ATCC: TIB-202）也从ATCC获得，并在T-75细胞培养瓶中培养为悬浮液（传代数14–22）。一旦细胞达到汇合并达到适当密度，它们被离心并分装到新的细胞培养瓶中。为了分化，THP-1细胞被收获、离心、重悬、培养和处理，使用佛波醇-12-肉桂酸-13-醋酸盐（PMA，25 ng/ml）诱导分化为类似巨噬细胞的细胞。分化后的THP-1巨噬细胞被播种在倒置Transwell插入件的下侧，如前所述详细描述（Ghadimi et al., 2024；Calatayud et al., 2019；Klein et al., 2013）。

所有细胞系均在37°C的湿化培养箱中培养，其中5% CO?和3%氧气（生理氧条件）使用Thermo Scientific Heracell 150i培养箱，配备可变氧气控制。所有细胞系均通过MycoStrip Mycoplasma检测试剂盒（InvivoGen，Toulouse，法国）按照制造商说明进行支原体污染检测。所有细胞培养的无内毒素状态通过LAL凝胶凝块试验（Pyrogent? Plus，Cat. #N294–03，Lonza，K?ln，德国）进行评估，检测灵敏度为0.3内毒素单位（EU）。

在感染实验中，细胞在达到>90%汇合后使用。

#### 2.5. 三细胞共培养

三细胞共培养按照之前描述的方法准备（Ghadimi et al., 2024），四阶段设置如图1所示。第0天：将达到汇合状态的T84细胞播种在Transwell插入件的膜上侧（如上所述）。第6天：在适合Transwell插入件的六孔板中播种达到汇合的Huh7细胞，72小时后T84极化完成。第8天：将含有极化T84细胞的Transwell插入件倒置在100 mm × 50 mm H型培养皿中。这种深解剖培养皿非常适合处理较大样本或必须完全浸没在培养基中的插入件。然后将类似巨噬细胞的THP-1细胞（每插入件0.8×10^6个细胞）播种在倒置Transwell膜的下侧，并培养6小时以允许附着。之后，插入件再次返回其原始方向，并放置在孔中。为了完成三细胞共培养组装，将培养8天的T84/THP-1共培养物直接放置在六孔Transwell兼容板的Huh7单层细胞上。根据实验组的要求调整合适的三细胞共培养物数量，并随后用于下一部分描述的炎症共培养模型。为了计算实验开始时每个插入件添加的细菌细胞数，另外包括两个单独的Transwell插入件仅用于细胞计数。这些细胞计数用于计算在细菌接种实验开始时的细菌与细胞比率（1.7:1）。

#### 2.6. 炎症共培养模型

作为初步质量控制步骤，共培养的T84、THP-1和Huh7细胞在倒置显微镜下检查以确保无污染。为了模拟感染相关的炎症环境，使用PAO1，因为它诱导的急性炎症反应类似于体内发生的炎症反应。

在接种三细胞共培养物之前，两个单独的插入件中的T84细胞首先被计数以确定细胞浓度，并随后计算细菌与细胞的比率。然后，为了确保细菌活力并准确量化实验开始时添加的细菌细胞数，使用Petroff-Hausser计数室进行直接显微镜计数，用甲基蓝染色。为此，将50 μl原始过夜细菌培养悬液（如第2.3节所述）添加到含有T84单层细胞的所需插入件的上侧。细菌以感染比（MOI）1.7:1添加到T84细胞上。这个比率近似于人体中细菌与人类细胞的比率，该比率在1:1和1.618之间。然后，将组装的三细胞共培养物在标准培养基或含有1 mg/ml头孢他啶的培养基中培养6小时。所有培养物在37°C、5% CO?和3%氧气（生理氧条件）的湿化培养箱中培养，使用Thermo Scientific Heracell 150i培养箱，配备可变氧气控制。每个实验至少测试两次重复，并且所有实验独立重复至少三次，以确保结果的有效性。实验结束后，进行以下程序。首先，从上室取出10 μl培养基，并将其放在Petroff-Hausser细菌计数室上，使用光学显微镜确定细菌数量。通过将6小时后剩余的细菌数量从初始添加的细菌数量中减去，计算细菌的生长或减少百分比。然后，将细菌数量除以初始数量，并乘以100。随后，培养基被吸出，离心以去除细胞和碎片，通过0.2 μm过滤器灭菌，并将上清液存放在–80°C以备后用。随后，为了评估T84细胞单层的完整性与功能，通过测量TEER来评估6小时暴露后T84细胞单层的通透性变化。背景阻力通过空培养插入件确定。将插入件中培养基单独的TEER值从测量的TEER值中减去，并将最终阻力计算为欧姆乘以插入件面积（Ω × cm2）。

#### 2.7. 共培养细胞的总ω-6脂肪酸谱分析

为了确定由亚油酸（LA; 18:2ω6）和辅酶Q10衍生的总ω-6脂肪酸，使用从重复孔中准备的池化细胞样品的一部分（样品I）来分析共培养细胞的总ω-6脂肪酸含量。分析使用人类ω-6脂肪酸ELISA试剂盒（Cat. #FAomega6 MBS756363；MyBioSource）进行，按照制造商的说明进行。样品在三重重复中测试，生成标准曲线并用于外推样品中的ω-6脂肪酸浓度。

#### 2.8. 共培养细胞的总辅酶Q10含量测定

总细胞辅酶Q10含量的提取使用每个池化细胞样品的另一部分（样品II）进行。辅酶Q10水平的定量使用人类辅酶Q10 ELISA试剂盒（Cat. #MBS165643；MyBioSource）进行，按照制造商的说明进行。样品在双重重复中分析。使用微孔板读数器（Tecan）在450 nm处测量光密度（OD）。生成标准曲线并用于外推样品中的辅酶Q10浓度。

#### 2.9. Th1和Th2型细胞因子蛋白分泌的测量

在共培养细胞中，Th1型细胞因子（IL-1β、IL-6）和Th2型细胞因子（IL-10）的分泌水平使用商业化的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（BD Biosciences或PeproTech GmbH）进行测量，按照制造商的说明进行。

#### 2.10. 细胞裂解物中的碱性磷酸酶活性测定

池化细胞悬液的第三部分（样品III）被处理以确定细胞裂解物中的碱性磷酸酶活性（ALP）。该测定在37°C下进行，使用p-硝基苯基磷酸（pNPP）作为底物，使用商业ALP测定试剂盒（Cat. #MAK447；Sigma-Aldrich，Taufkirchen，德国）进行，按照制造商的协议进行。简要来说，细胞用含有10 mM Tris-HCl（pH 8.0）、1 mM MgCl?和0.5% Triton X-100的裂解缓冲液洗涤并裂解。裂解物在10,000 rpm下离心5分钟，收集上清液，并用25 μl的重复样本进行ALP活性测定。通过在405 nm处测量p-硝基苯酚的吸光度（光密度）使用GENios Tecan微孔板读数器。ALP活性以样本均值单位/毫升（U/ml）表示，±均值的标准误差（SEM）。

#### 2.11. 细胞裂解物和培养上清液的代谢标记分析

T84、THP-1和Huh7细胞在6孔Transwell插入件中共培养，并按照上述方法（如“炎症共培养模型”部分所述）处理。6小时培养后，收集共培养细胞的上清液并存放在–80°C。然后，细胞用DPBS洗涤两次，并使用一次性无菌小型细胞刮刀分别从细胞培养插入件和孔中小心刮取。细胞被转移到单独的15 ml或50 ml管中，并在室温下离心5分钟。离心后，去除上清液，收集细胞沉淀并重悬于预热的细胞培养基中。然后，将池化细胞悬液的约10 μl与10 μl 0.4% trypan blue染料混合，进行细胞计数。随后，将10 μl该混合物加载到改进的Neubauer计数室（Millicell Disposable Hemocytometer，MDH-4N1，Merck Darmstadt，德国）中。使用计数室确定存活和非存活细胞的数量，并计算细胞存活率作为总细胞数中存活细胞的百分比。剩余的细胞悬液被分为三部分，并进一步处理以同时确定总辅酶Q10含量、总ω-6水平和碱性磷酸酶活性测定，如后续部分所述。

#### 2.12. 竞争排斥实验

竞争排斥实验按照之前描述的方法进行（Ghadimi et al., 2024），略有调整。在重复的六孔Transwell培养插入件中，达到汇合状态的T84细胞被以每孔2.4×10^5个细胞的密度播种在每个插入件的膜内侧（如上所述）。细胞在7–8天内培养，然后进行附着实验。细菌株PAO1和L. casei被用DPBS洗涤两次。然后将100 μl PAO1悬液（10^8 CFUs）和100 μl L. casei悬液（10^8 CFUs）同时添加到每个插入件中。培养在37°C下进行90分钟。之后，单层细胞用DPBS洗涤两次，并用TrypLE Express酶消化。附着细菌的系列稀释被接种在LB琼脂上用于PAO1和MRS琼脂上用于L. casei。平板在37°C下培养24–48小时，然后计数菌落形成单位（CFUs）。

#### 2.13. 统计分析

数据使用STATGRAPHICS Plus统计软件版本4.1（Statgraphics Technologies, Inc., Virginia, USA）进行分析。所有测量均来自体外实验中培养的细胞，并以均值±均值的标准误差（SEM）表示。每个实验条件在每个实验中测试两次（技术重复），并且所有实验独立重复至少三次以考虑生物变异性（如不同的传代或独立重复的培养），导致每个处理-培养基组有六个观察值，所有组共有48个观察值。在统计分析之前，数据通过Shapiro-Wilk检验进行正态性测试，并通过Levene检验进行方差齐性测试。根据数据分布：两组之间的比较使用Student’s t检验（参数）或Mann-Whitney U检验（非参数）。多组之间的比较（即四个处理组）使用单因素方差分析（ANOVA）进行正态分布数据或Kruskal-Wallis检验进行非正态分布数据。当发现显著差异时，使用Tukey's HSD检验（参数）或Dunn’s检验（非参数）进行事后成对比较。在整个研究中，p值<0.05被视为统计学显著。为了确保足够的统计功效，假设中等效应大小（Cohen’s d = 0.5）、显著性水平α = 0.05和期望的功效80%（0.80），进行了功效分析。分析确认所使用的样本量足以检测处理组之间的统计学显著差异。

### 3. 结果

#### 3.1. 细胞活力

测试处理对三种共培养细胞的生理细胞健康的影响呈现出相似的模式，但敏感性有所不同。暴露于PAO1单独的T84细胞单层在6小时后显著（p < 0.01）降低细胞活力至44.3 ± 3.0%（与未处理对照细胞相比）。相比之下，单独使用L. casei的处理使细胞活力略微增加至109.3 ± 3.1%。因此，与PAO1不同，L. casei在三细胞共培养模型中维持了最佳的生理细胞健康，没有对肠道细胞产生毒性作用。此外，L. casei在6小时实验中显著减轻了PAO1引起的T84细胞活力的降低，减少了10.5%。当共培养细胞在含有头孢他啶的DMEM中培养时，PAO1引起的细胞活力降低进一步被抑制了30.6%（p < 0.01）。L. casei和头孢他啶的组合治疗减轻了PAO1引起的细胞毒性，减少了33.7%。这表明，头孢他啶和L. casei的组合治疗并不表现出协同或相加效应，这与最初的预期不符。这种缺乏协同作用可能是由于头孢他啶对L. casei的生长和存活的轻微抑制作用，如图7B所示。

#### 3.2. LA-producing L. casei和头孢他啶对T84细胞单层在PAO1挑战下肠道屏障功能的保护作用

跨上皮电阻力（TEER）是评估肠道屏障完整性的一个有价值的指标。如图3所示，当共培养细胞在DMEM中培养时，PAO1处理单独显著降低了T84细胞的TEER值，导致TEER值比未处理对照细胞降低了48.1%。相比之下，单独使用L. casei的处理在6小时后使TEER值增加了119.2%。此外，L. casei显著减轻了PAO1引起的TEER值降低，如图3B所示。当共培养细胞在含有头孢他啶的DMEM中培养时，PAO1引起的TEER值降低被显著抑制了45.1%。T84细胞在DMEM中单独处理时，TEER值几乎与对照细胞相似（104.5%），这表明在三细胞共培养模型中，L. casei对肠道上皮细胞屏障功能的完整性没有产生任何不利影响。然而，当比较含有头孢他啶的TEER值（104.0%）与不含头孢他啶的TEER值（119.0%）时，含有头孢他啶的TEER值较低。这表明头孢他啶轻微抑制了L. casei的有益作用。与细胞活力的实验结果相似，L. casei和头孢他啶的组合治疗恢复了PAO1抑制的TEER值。组合治疗表现出比单独治疗更有效的反应，尽管这不是相加效应，因为组合效应并不等于单独治疗的总和。这些结果支持了这样一个想法：虽然头孢他啶和L. casei细菌在单独或组合治疗中对缓解显性感染性炎症和通过改善屏障功能保护肠道上皮细胞有效，但它们的组合效应并不相加。这可能是由于头孢他啶与L. casei分泌的成分之间的复杂分子间键（相互作用）可能在组合表型效应中发挥关键作用。

#### 3.3. 在PAO1挑战下，Th1和Th2细胞因子相关肠道屏障完整性调节的细胞内膜脂质（ω-6）和脂溶性抗氧化剂（CoQ10）的调节

CoQ10是人体唯一能够合成的脂溶性抗氧化剂，其溶解性保护脂蛋白和脂质免受过氧化和氧化损伤。

当共培养细胞在DMEM中培养时，与LA和CoQ10相关的细胞膜脂质和脂溶性抗氧化剂的水平在PAO1或L. casei处理下显示出变化的模式。共培养的T84、THP-1和Huh7细胞的CoQ10含量如表1所示。

#### 3.4. 抗生素对宿主-病原体相互作用影响葡萄糖的调节作用

在宿主-病原体代谢伙伴关系中，四个复杂的生化和微生物事件密切相关：i）糖、脂肪和氨基酸的代谢途径相互关联，并且紧密联系到免疫细胞的生存和激活；ii）宿主和病原体在感染期间竞争葡萄糖和铁，葡萄糖利用还与抗生素耐受性有关（即需要更长的暴露时间才能使抗生素有效）；iii）微生物代谢的重新编程依赖于营养可用性，包括宿主来源的脂质；iv）感染会诱导宿主细胞内的代谢扰动。因此，我们测量了葡萄糖、铁、HDL-C和甘油三酯（TG）的水平作为宿主代谢防御的指标。为了评估葡萄糖消耗率，我们量化了6小时培养后培养基中剩余的葡萄糖浓度。如图5A所示，在未感染的对照细胞（无细菌）中，当它们在培养基中或含有头孢他啶的培养基中培养时，基础培养基中的葡萄糖水平没有显著差异。注意，DMEM培养基中初始葡萄糖浓度为4.5 g/L（相当于97.83 mmol/L）。补充头孢他啶的DMEM培养基导致细胞葡萄糖消耗略有增加，如培养基中葡萄糖水平较低所示，尽管这种差异不具有统计学意义。相比之下，PAO1感染导致培养基中葡萄糖水平显著减少。这种葡萄糖消耗效应在头孢他啶存在下被抑制，表明PAO1感染激活了宿主细胞的糖酵解并增强了细胞的葡萄糖摄取。增加的葡萄糖摄取不仅是大多数癌细胞的内在特征，也是宿主细胞被细菌病原体感染的特征。有趣的是，与许多病原体不同，假单胞菌更倾向于利用有机酸或氨基酸而不是葡萄糖作为能量来源，这是一种与感染驱动的宿主代谢调节相关的策略。因此，观察到的葡萄糖消耗可能反映了感染宿主细胞的代谢活动和葡萄糖利用的增加，而不是病原体自身的消耗。另一方面，当细胞在DMEM培养基中培养时，单独使用L. casei的处理并没有显著改变培养基中的葡萄糖水平，尽管L. casei本身消耗葡萄糖。然而，在含有头孢他啶的培养基中，L. casei处理的细胞培养基中的葡萄糖水平显著降低，与不含头孢他啶的DMEM相比。这些结果表明：i）假单胞菌PAO1和产生亚油酸的L. casei对宿主细胞的葡萄糖代谢有相反的影响；ii）抗生素和生物免疫调节剂（如有益细菌）可能对宿主细胞代谢产生矛盾和双向的影响——其中一些可能是治疗有益的，而另一些可能导致意外的后果。在此背景下，宿主细胞和病原体之间铁和葡萄糖代谢的对话比想象的更复杂，常常导致该界面内生物活性参与者（宿主和病原体）的多种生理变化。

#### 3.5. 抗生素对宿主-病原体相互作用影响甘油三酯的调节作用

在宿主-病原体代谢伙伴关系中，四个复杂的生化和微生物事件密切相关：i）糖、脂肪和氨基酸的代谢途径相互关联，并且紧密联系到免疫细胞的生存和激活；ii）宿主和病原体在感染期间竞争葡萄糖和铁，葡萄糖利用还与抗生素耐受性有关（即需要更长的暴露时间才能使抗生素有效）；iii）微生物代谢的重新编程依赖于营养可用性，包括宿主来源的脂质；iv）感染会诱导宿主细胞内的代谢扰动。因此，我们测量了葡萄糖、铁、HDL-C和甘油三酯（TG）的水平作为宿主代谢防御的指标。为了评估葡萄糖消耗率，我们量化了6小时培养后培养基中剩余的葡萄糖浓度。如图5A所示，在未感染的对照细胞（无细菌）中，当它们在培养基中或含有头孢他啶的培养基中培养时，基础培养基中的葡萄糖水平没有显著差异。注意，DMEM培养基中初始葡萄糖浓度为4