《Virology》：Evaluation of the contribution of hemagglutinin-neuraminidase to the endocytic entry of Newcastle Disease Virus
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新城疫病毒（NDV）通过 caveolae介导的内吞作用进入宿主细胞，但病毒蛋白与内吞体膜融合的分子机制尚未明确。本研究构建了HN蛋白 stalk区（89、94位）和球状头部site II（516位）的突变体，发现 stalk区突变显著抑制HN-F蛋白相互作用及内吞体膜融合，而site II突变仅轻微降低融合活性，但未影响受体结合。反向遗传学证实，两种突变均降低病毒与受体的结合能力，但仅 stalk区突变影响内吞体膜融合。研究还揭示酸性环境对NDV内吞体膜融合触发至关重要。HN蛋白不同位点氨基酸的保守性分析表明，病毒内吞进入细胞与毒力及基因型无关。
赵然|韩宗曦|李慧新|邵宇豪|孙俊峰|刘胜旺
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疾病控制与预防国家重点实验室禽传染病科，哈尔滨150069，中华人民共和国
摘要
本文介绍了新城疫病毒（NDV）通过 Caveolae 介导的内吞作用进入目标细胞的过程。然而，参与内吞作用及细胞内内体中病毒融合的病毒因子仍不甚清楚。本研究探讨了 NDV 的 HN 茎区以及位于球形头部区域的第二个受体结合位点（位点 II）在内吞作用和病毒-细胞膜融合中的潜在作用。首先构建了在茎区第 89 位和第 94 位以及位点 II 第 516 位发生突变的 HN 蛋白。实验结果表明，HN 茎区的突变限制了其与 F 蛋白的相互作用及融合促进能力；而位点 II 的突变仅轻微降低了融合促进能力，未影响 HN-F 之间的相互作用。通过反向遗传学技术获得的 HN 突变体病毒进一步评估其受体结合能力和内吞能力后发现，茎区和位点 II 的突变均降低了 NDV 与受体的结合能力。有趣的是，位点 II 并不参与 NDV 的内吞过程及随后的内体中病毒-细胞膜融合，而 HN 茎区的第 89 位和第 94 位残基则参与了 NDV 在内体中的融合。值得注意的是，酸性环境对于 NDV 在内体中有效触发融合至关重要。此外，HN 茎区的第 89 位和第 94 位残基在不同基因型的 NDV 中是保守的，NDV 的内吞过程并不受病毒毒力或基因型的影响。
引言
副粘病毒属于Paramyxoviridae科，是一类具有包膜的负链 RNA 病毒，包括多种人类和动物病原体（Chang 和 Dutch, 2012）。副粘病毒的包膜含有两种表面糖蛋白：附着蛋白（HN、H 或 G）和融合蛋白（F）。副粘病毒进入细胞需要附着蛋白与细胞受体结合，随后 F 蛋白介导病毒包膜与细胞膜的融合（Jardetzky 和 Lamb, 2014）。尽管大多数副粘病毒在中性 pH 条件下通过直接与细胞表面的质膜融合进入目标细胞，但最新研究表明它们也可利用细胞内吞途径进行感染（Kolokoltsov 等, 2007; Krzyzaniak 等, 2013; Pernet 等, 2009）。
新城疫病毒（NDV）是副粘病毒的代表（Alexander, 2000）。除了与细胞表面的质膜融合外，NDV 进入不同细胞还涉及多种内吞途径，包括 Caveolae 介导的内吞（CavME）、Clathrin 介导的内吞（CME）和巨噬细胞吞噬（Cantin 等, 2007; Fan 等, 2024; Tan 等, 2018; Zhao 等, 2021）。这些发现表明 NDV 可能利用内吞途径的酸性环境来触发融合并释放负链核衣壳到细胞质中。然而，NDV 在内吞后酸性内体环境中触发融合的具体机制仍不甚明确。
通常情况下，NDV 在中性 pH 条件下需要血凝素-神经氨酸酶（HN）蛋白与 F 蛋白之间的特异性相互作用来触发融合（Jardetzky 和 Lamb, 2014）。NDV 的 HN 蛋白是一种同源四聚体 II 型膜蛋白，包含一个 N 端跨膜结构域和一个由茎区和 C 端球形头部结构域组成的外域（Yuan 等, 2011）。多项研究表明，HN 的茎区负责其与 F 蛋白的相互作用并参与膜融合的调节，而球形头部结构域则负责与含有唾液酸的受体结合（Bousse 等, 2004; Iorio 等, 2001）。通过晶体结构分析，已在 NDV 的 HN 蛋白中鉴定出两个受体结合位点（位点 I 和 II）（Zaitsev 等, 2004）。位于 HN 球形头部结构域的大口袋中的位点 I 具有受体结合和神经氨酸酶（NA）活性，而位于二聚体界面处的位点 II 仅具有受体结合活性。另有推测认为，HN 蛋白中的位点 II 可能识别特定受体从而启动 NDV 的内吞过程（Cantin 等, 2007; Sanchez-Felipe, Villar, 和 Munoz-Barroso, 2014）。先前对蛋白突变体的研究表明，HN 茎区的第 89 位和第 94 位残基可调节 F 蛋白的融合活性，而不影响血凝作用和 NA 活性（Melanson 和 Iorio, 2004）。此外，HN 蛋白第 94 位的突变会损害病毒的受体识别能力、NA 活性和融合促进能力（Liu 等, 2015）。对于位点 II，第 516 位被确定为参与 HN 蛋白融合促进的关键残基（Bousse 等, 2004; Connaris 等, 2002; Iorio 等, 2001）。最近的研究发现，NDV 可通过 CavME 进入鸡巨噬细胞系（HD11）并运输到早期内体（Zhao 等, 2021）。由于内体中的特定环境条件，酸性内体中的融合触发机制可能与中性 pH 条件下的机制不同。NDV 通过 CavME 进入 HD11 细胞的过程中，HN 蛋白与 F 蛋白以及位点 II 之间的相互作用对其融合过程的影响仍有待进一步研究。
在本研究中，构建了在茎区（第 89 位和第 94 位）和位点 II（第 516 位）发生氨基酸突变的 HN 突变体。研究了这些 HN 突变体与 F 蛋白之间的相互作用及其融合促进能力，并利用反向遗传系统生成了重组 HN 突变体病毒。随后评估了 HN 蛋白茎区和位点 II 的氨基酸对 NDV 在 HD11 细胞内吞及内体中融合的贡献。
实验部分
病毒、细胞和鸡蛋
本研究使用了五种新城疫病毒株：IX 型强毒株 F48E9、VII 型强毒株 ck/CH/LHLJ/1/06 和 Mallard/CH/HLJ127/06、III 型中等毒株 Mallard/CH/HLJ383/06、II 型弱毒株 La Sota、I 型弱毒株 FJ28（Shao 等, 2018; Sun 等, 2022; Sun 等, 2017; Wu 等, 2015; Xu 等, 2017），以及表达 T7 RNA 聚合酶的改良痘病毒 MVA（Ge 等, 2007）。实验使用的细胞为鸡巨噬细胞系 HD11。
F 和 HN 蛋白的表达与相互作用鉴定
构建了表达 F 蛋白（与 C 端 HA 标签融合）以及野生型 HN 蛋白、HN-A89Q、HN-L94A 和 HN-R516A 突变体的质粒。转染后，使用针对 HA 标签和 HN 蛋白的单克隆抗体通过免疫荧光（IFA）检测 HD11 细胞中这些质粒编码的 F 和 HN 蛋白的表达情况。如图 1A 所示，转染了质粒 pCAG-HA-F48-F、pCAG-F48-HN、-A89Q、-L94A、-R516A 的 HD11 细胞显示出绿色荧光，而未转染的细胞则没有荧光。讨论
大量证据表明，副粘病毒的细胞进入机制比之前认为的更为复杂（Chang 和 Dutch, 2012; Dutch, 2010; Jardetzky 和 Lamb, 2014）。例如，NDV 不仅可以通过与质膜融合进入细胞，还可以通过 Caveolae 介导的内吞（CavME）进入 COS-7、Hela、LMH 和 HD11 细胞；同时，CME 和巨噬细胞吞噬也参与了 NDV 进入 DF-1 和树突状细胞的过程（Cantin 等, 2007; Fan 等, 2024; Tan 等, 2018; Zhao 等,
CRediT 作者贡献声明
刘胜旺：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金申请。
孙俊峰：撰写 – 原稿撰写，验证，监督。
邵宇豪：验证，软件操作。
李慧新：验证，方法学设计。
韩宗曦：方法学设计，实验实施。
赵然：撰写 – 原稿撰写，方法学设计，实验实施
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
竞争利益声明
作者声明没有已知的可能会影响本文研究结果的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了中国农业研究系统（CARS-40-K18）的资助。
