大麻二酚（CBD）作为HLA-G表达的新型抑制剂：揭示其在绒毛膜癌免疫调节中的潜力

《Scientific Reports》：Cannabidiol (CBD) as a novel inhibitor of HLA-G expression in human choriocarcinoma cell line (JEG-3)

本研究针对肿瘤免疫逃逸关键分子HLA-G的调控机制，首次发现大麻二酚（CBD）及其高含量提取物（CBD-HCE）能够动态可逆地抑制人绒毛膜癌细胞JEG-3中HLA-G的表达。通过MTT法确定安全浓度后，研究人员证实CBD/CBD-HCE可显著抑制细胞增殖、迁移并诱导凋亡，同时下调HLA-G的mRNA和蛋白水平。该发现为基于CBD的肿瘤免疫治疗策略提供了新思路。

在肿瘤免疫治疗领域，肿瘤细胞通过多种机制逃避免疫监视一直是制约疗效的关键难题。其中，非经典HLA I类分子HLA-G（Human Leukocyte Antigen-G）作为重要的免疫检查点分子，在介导肿瘤免疫逃逸中扮演着关键角色。尽管大麻素类化合物在癌症研究中的抗肿瘤特性日益受到关注，但它们对免疫检查点调控的影响，特别是对HLA-G表达的影响，至今尚未明确。

近期发表在《Scientific Reports》的一项创新性研究首次揭示了大麻二酚（CBD）及其高含量提取物（CBD-HCE）对人绒毛膜癌JEG-3细胞中HLA-G表达的抑制作用。研究人员选择组成性高表达HLA-G的JEG-3细胞系作为模型，通过系统实验证实了CBD及其提取物在抑制肿瘤细胞恶性表型的同时，能够显著下调这一关键免疫抑制分子的表达。

研究团队采用MTT法确定安全浓度后，通过免疫细胞化学、RT-qPCR、伤口愈合实验等技术系统评估了CBD和CBD-HCE对JEG-3细胞增殖、凋亡、迁移及HLA-G表达的影响。

CBD和CBD-HCE诱导人绒毛膜癌细胞死亡

通过Caspase-3（Cas-3）标记分析CBD和CBD-HCE在JEG-3细胞中的促凋亡效应，结果显示两种处理均呈现显著较高的值（p<0.001）。与对照组培养物中观察到的值（0.15±0.02）相比，CBD（1μM：0.23±0.003和5μM：0.24±0.007）和CBD-HCE（1μM：0.23±0.002和5μM：0.24±0.006）处理均显著提高。两种大麻素处理之间未观察到显著差异（p>0.05）。

CBD和CBD-HCE抑制人绒毛膜癌细胞增殖

使用Ki-67免疫标记的增殖分析显示，与对照组（76.23%±1.76）相比，CBD（1μM：51.78%±1.96；5μM：45.47%±3.71）和CBD-HCE（1μM：43.32%±2.45；5μM：42.17%±2.76）处理后增殖细胞百分比显著降低（p<0.001）。相同浓度下CBD和CBD-HCE之间未观察到显著差异（p>0.05）。

与Ki-67数据一致，有丝分裂指数分析也显示对照组中M期细胞百分比（19.93%±1.05）显著高于CBD（1μM：9.92%±0.57；5μM：9.27%±0.47）和CBD-HCE（1μM：9.29%±0.27；5μM：8.07%±0.38）处理组（p<0.001）。

CBD和CBD-HCE抑制人绒毛膜癌细胞迁移

单层损伤后，24小时伤口闭合百分比在对照组（60.30%±5.50；p<0.01）显著高于用1μM CBD（39.90%±3.90）或1μM CBD-HCE（41.60%±3.60）处理的培养物。每个值代表每次处理八个独立重复（n=8）的平均值±SEM。随后在30小时和40小时的测量显示所有条件下伤口面积逐渐减少。虽然对照组培养物在40小时达到完全汇合，但处理组培养物表现出较慢的再生反应，表明实现完全闭合需要额外的培养时间。

迁移试验期间细胞增殖和凋亡评估显示，与对照细胞（23.96%±1.50）相比，用CBD（11.44%±0.21）和CBD-HCE（9.81%±0.65）处理的培养物在24小时有丝分裂指数（M期）显著降低。类似地，与对照组（64.20%±3.72）相比，处理培养物中Ki-67免疫标记细胞显著较低（p<0.001）（CBD：42.18%±4.21和CBD-HCE：37.58%±5.24）。关于凋亡，处理组和对照组细胞之间未观察到显著差异（p>0.05；对照：0.030±0.004，CBD：0.024±0.005，CBD-HCE：0.024±0.006；n=15）。与细胞迁移相关的另一个参数是MMP-9表达。MMP-9免疫染色显示，与对照组（0.0079±0.0007）相比，两个大麻素处理组均显著降低（p<0.001），CBD-HCE处理细胞显示最低表达水平（CBD：0.0043±0.0006；CBD-HCE：0.0018±0.0007）。

CBD和CBD-HCE下调mRNA和蛋白HLA-G表达

RT-qPCR分析显示，用1μM和5μM CBD孵育后HLA-G mRNA表达显著降低。表达水平显示为相对于RPL7参考基因标准化的相对值。在未处理对照（t=0）中，HLA-G mRNA水平为0.153±0.006。对于两种浓度，在12小时、24小时和36小时评估mRNA水平。在1μM CBD下，与对照相比，所有时间点HLA-G表达均显著降低（p<0.001），24小时（0.030±0.003）和36小时（0.028±0.003）的值低于12小时（0.059±0.006）。在5μM CBD下观察到类似模式，所有时间点表达水平也显著低于对照（p<0.001）：0.030±0.003（12小时）、0.023±0.002（24小时）和0.037±0.001（36小时）（n=8）。

为了进一步确认和扩展我们的发现，我们研究了使用1μM高CBD提取物（CBD-HCE）是否可以复制CBD对HLA-G的抑制效应。一致地，两种处理在1μM下导致HLA-G表达与对照（0.154±0.01）相比显著降低（p<0.001）（CBD-HCE：12小时：0.0463±0.003；24小时：0.0353±0.01和36小时：0.04548±0.005）。

免疫细胞化学分析显示处理组和对照组细胞培养物之间HLA-G蛋白水平存在明显差异。HLA-G定量免疫标记面积显示，与标准化为1（100%）作为参考值的对照相比，用1μM（0.54±0.03）和5μM（0.54±0.02）CBD处理的细胞显著减少。类似地，CBD-HCE处理导致HLA-G表达显著降低（p<0.001），1μM值为0.72±0.07，5μM值为0.38±0.09（n=15）。此外，在5μM CBD-HCE下观察到的减少显著大于1μM下（p<0.001）。

CBD对HLA-G的下调是可逆的

处理前（t=0），HLA-G mRNA表达为0.153±0.006。如上所述，细胞暴露于1μM CBD导致mRNA水平显著降低。CBD去除并更换为无CBD培养基后，在无药物条件下观察到显著表达恢复。去除后24小时（t=60小时），表达水平开始恢复（0.062±0.002；p<0.01），至36小时（t=72小时），已恢复至基线值（0.151±0.009；p<0.001）。数据代表八次独立实验（n=8）的平均值±SEM。

本研究首次提供了CBD和CBD丰富提取物抑制肿瘤细胞增殖和迁移同时下调HLA-G（一种参与肿瘤免疫逃逸的关键免疫检查点分子）的新体外证据。尽管我们的工作受限于使用单一细胞系，需要在其他肿瘤类型和体内模型中验证，但它为未来研究奠定了基础。此外，必须确定我们观察到的抑制模式是CBD特异性还是与其他植物大麻素（如THC或CBG）共享，以及这些效应是否依赖经典大麻素受体或涉及替代信号通路。免疫细胞群中的功能测定也将是确认这种调节的免疫调节影响所必需的。最后，未来研究应阐明它们是否更密切关联于纯化合物还是具有特定大麻素比例的特征性富集提取物。

虽然这些问题仍然开放，但我们的发现提供了将CBD与HLA-G调控联系起来的首个实验证据，强调了CBD作为在癌症免疫治疗背景下具有转化相关性的免疫调节化合物的潜力。