scFFPE-ATAC技术突破：实现福尔马林固定石蜡包埋样本的高通量单细胞染色质可及性分析

《Nature Communications》：scFFPE-ATAC enables high-throughput single cell chromatin accessibility profiling in formalin-fixed paraffin-embedded samples

研究团队针对FFPE样本无法进行单细胞染色质可及性分析的难题，开发了scFFPE-ATAC新技术，整合FFPE适配Tn5转座酶、超高通量DNA条形码(>5600万/次)、DNA损伤修复和体外转录系统，成功解析了存档8-12年临床样本的单细胞表观异质性，揭示了肿瘤中心与侵袭边缘的调控轨迹及淋巴瘤复发转化的表观动态，为回顾性表观遗传研究提供了强大工具。

在临床和生物医学研究中，福尔马林固定石蜡包埋（Formalin-Fixed Paraffin-Embedded, FFPE）样本是组织保存的金标准，全球医院病理科室存档的FFPE样本超过4亿至10亿份。然而，由于甲醛固定造成的广泛DNA损伤，当前的单细胞染色质可及性技术无法解析FFPE组织中的细胞类型特异性表观遗传特征。肿瘤复发和转移仍是癌症治疗的主要挑战，而可逆的表观遗传修饰可能在转移过程中发挥关键作用。因此，在配对的原发和复发肿瘤样本中分析表观遗传景观对于解读肿瘤进展和治疗抵抗的机制至关重要。

为了解决这一技术难题，Uppsala大学的研究团队开发了scFFPE-ATAC，一种用于FFPE样本的高通量单细胞染色质可及性检测方法，相关成果发表在《Nature Communications》上。该技术整合了FFPE适配的Tn5转座酶、超高通量DNA条形码（每次运行>5600万个条形码）、介导的DNA损伤修复和体外转录系统。研究人员使用FFPE小鼠脾脏样本对scFFPE-ATAC进行了基准测试，并与新鲜组织进行了性能验证。

研究团队应用该技术分析了存档8-12年的人淋巴结样本和肺癌FFPE组织，揭示了肿瘤中心与侵袭边缘之间的不同调控轨迹。对存档的滤泡性淋巴瘤（Follicular Lymphoma, FL）和转化为弥漫性大B细胞淋巴瘤（Diffuse Large B-Cell Lymphoma, DLBCL）的样本分析，识别了与复发和转化相关的表观遗传动态。scFFPE-ATAC使得在长期存档的标本中进行回顾性、空间和机制性表观遗传研究成为可能。

关键技术方法包括：通过密度梯度离心从FFPE样本中纯化细胞核；使用新设计的FFPE-Tn5转座酶进行标签化；通过三轮连接（96×96×96条形码组合）实现单细胞索引；T7启动子介导的DNA损伤救援和体外转录（IVT）；以及单链cDNA制备和测序文库构建。样本来源包括小鼠脾脏、人淋巴结（存档8-12年）、人肺癌FFPE组织（肿瘤中心和侵袭边缘穿刺获取）以及配对的FL和DLBCL临床存档样本。

研究结果通过多个维度进行展示：

Conventional scATAC-Seq fails to resolve cell-type-specific epigenetic profiles in FFPE samples

研究发现，常规scATAC-seq在FFPE样本中无法解析细胞类型特异性表观特征。通过密度梯度离心优化，虽然从FFPE样本中获得了纯化的细胞核，但DNA片段分布显示只有短片段（50-300 bp）被富集，反向交联（+RV）条件虽提高了DNA产量，但未能改善可及染色质区域的恢复。scATAC-seq数据中，FFPE样本的库复杂度显著降低， median重复率在-RV和+RV条件下分别为57.41%和68.85%，而新鲜样本为34.73%。 median FRiP（峰值读取分数）在FFPE样本中为29.95%（-RV）和28.93%（+RV），远低于新鲜样本的42.01%。即使降低过滤阈值，也无法识别出细胞类型特异性基因，表明常规方法在FFPE样本中失败。

Development of scFFPE-ATAC: A single-cell chromatin accessibility profiling method for FFPE samples

scFFPE-ATAC采用新设计的FFPE-Tn5系统，结合标准Tn5转座酶和携带64个DNA条形码的定制适配器，通过三轮分池连接（96x96x96条形码组合）索引单个细胞，总细胞条形码数达56,623,104。T7启动子位于第三次连接条形码末端，IVT系统从所有断裂的可及染色质位点生成RNA分子，救援FFPE细胞核中的DNA断裂效应。该技术在线粒体样本中鉴定了18,200个细胞相关DNA条形码， merged数据的TSS富集分数为7.5，虽低于新鲜样本，但保持了相似的TSS富集模式。 median重复率（30.81%）、FRiP（21%）和唯一DNA片段数（2722）均优于常规scATAC-seq在FFPE中的表现，表明scFFPE-ATAC提高了单细胞库复杂度。

scFFPE-ATAC decodes single-cell chromatin accessibility in clinically archived FFPE human lymph node tissue stored for 8-12 years

在存档8-12年的人FFPE淋巴结样本中，scFFPE-ATAC显示出清晰的TSS富集（TSS富集分数≥4）， median FRiP为13.87%，唯一DNA片段数为1356，重复率为48.5%。从四个样本中获得12,243个高质量细胞，片段分布以短片段为主（96.28%在0-100 bp范围）。高维降维识别出五种细胞类型：髓样细胞、T细胞和三种B细胞亚型（B细胞S1、S2、S3）。基因活性预测揭示了细胞类型特异性活跃基因，如CD19在B细胞中活跃，ICOS和GZMK在T细胞中活跃。差异可及染色质峰分析识别出各细胞类型的独特峰，TF富集分析发现了细胞类型和谱系特异性TF，如T细胞中的BATF::JUN、EOMES，髓样细胞中的CEBP家族TF，B细胞中的EBF1和TCF3。

scFFPE-ATAC uncovers spatially distinct epigenetic regulators driving tumor progression from the tumor center to the invasive edge in FFPE human lung cancer

在人类肺癌FFPE组织中，从肿瘤中心（TC）和侵袭边缘（IE）穿刺取样，scFFPE-ATAC捕获了11,564个高质量细胞（IE 6731个，TC 4833个）。高维降维识别出六个组分：上皮细胞、T细胞、髓样细胞、基质细胞、B细胞S1和B细胞S2。基因活性预测显示细胞类型特异性基因活跃，如上皮细胞中的CYP4B1和LAMC2。比较TC和IE上皮细胞的染色质可及性，识别出22,219个TC特异峰和14,610个IE特异峰。基因通路富集显示，IE中Wnt信号、细胞生长、间充质细胞分化和Ras蛋白信号转导通路富集，而TC中细胞-细胞粘附和白细胞相互作用调控通路富集。TF富集分析发现，TC中POU5F1B、RUNX2等TF维持干细胞样特性，IE中FOS、JUN、FOXC2等TF驱动上皮-间质转化（EMT）。 pseudotime轨迹分析揭示了上皮肿瘤细胞从TC到IE的两条 distinct表观遗传轨迹，轨迹1 enriched细胞分裂相关通路，轨迹2 enriched区域化相关通路，表明不同的调控程序 underlying空间肿瘤进化。

scFFPE-ATAC identifies key epigenetic drivers of tumor relapse from paired primary and relapsed tumor FFPE samples

在配对的原发和复发FFPE肿瘤样本中， scFFPE-ATAC分析了从FL转化为DLBCL（7年间隔）和FL复发为FL（2年间隔）的样本，捕获了13,357个高质量细胞。高维降维识别出两个肿瘤B细胞群（Tumor B1和Tumor B2）以及髓样细胞、B细胞和T细胞。在转化为DLBCL的患者中，Tumor B1比例从85.22%降至12.75%，Tumor B2从0.6%增至8.53%；在复发FL的患者中，Tumor B1从2.89%增至74.56%，Tumor B2从32.58%降至11.50%。基因活性预测显示，Tumor B1中LMO2、LYN、TNFRSF17等癌基因活跃，Tumor B2中BCL2、WAS活跃。TF富集分析发现，Tumor B1中ZEB1、SNAI2、ID4等TF enriched，Tumor B2中HIC2、RHOXF1等TF enriched。 pseudotime轨迹分析显示，从正常B细胞到肿瘤B细胞的两条轨迹路径，Tumor B1形成轨迹1，Tumor B2形成轨迹2。差异可及染色质峰分析识别出原发和复发肿瘤中的特异峰和 enriched TF，如DLBCL中CREB1、SOX4、PAX5等TF富集，复发FL中ALX3、MIXL1、MAFK等TF富集。

研究结论表明，scFFPE-ATAC能够可靠地分析FFPE样本的单细胞染色质可及性，揭示单细胞表观异质性和细胞组成。该技术成功应用于多种存档FFPE组织格式，包括穿刺芯和组织切片，即使经过十多年的储存仍能解析单细胞表观景观。作为案例研究，在长期存档的人淋巴结样本中， scFFPE-ATAC在8-12年的FFPE保存后成功分析了单细胞表观调控；在肺癌样本中，比较了肿瘤中心和侵袭边缘的单细胞表观特征，识别出区域特异性表观调控因子；在配对的FL和DLBCL样本中，识别了复发和转化相关的关键表观遗传元素。 pseudotime轨迹分析揭示了复发和转化肿瘤细胞的不同表观进化路径，为疾病进展的分子事件提供了 insights。

讨论部分强调，肿瘤异质性是癌症治疗的主要挑战， contributing to肿瘤进展、治疗抵抗和复发。表观遗传在肿瘤起始、进展和复发中发挥关键作用。尽管临床存档的 patient-derived样本99%以上以FFPE形式存储，但技术障碍长期阻碍了 fully理解肿瘤异质性、复发和转移。 scFFPE-ATAC填补了这一技术空白，为研究存档FFPE组织中的肿瘤异质性、复发和空间进展提供了单细胞分辨率的强大工具。该技术开启了回顾性临床研究的 avenues， facilitating生物标志物和治疗靶点的发现。展望未来， scFFPE-ATAC有潜力驱动空间表观基因组学和多组学整合的发展， ultimately advancing基础研究和个性化医学领域。

重要意义在于， scFFPE-ATAC使得在长期存档的生物医学和临床FFPE标本中进行高通量、高灵敏度染色质可及性分析成为可能，为肿瘤进展、复发和转移的机制研究提供了更深 insights，并为FFPE样本的空间表观分析和多组学整合奠定了基础。