猛犸象古RNA破译：万年肌肉转录组的重生与演化启示

《Cell》：Ancient RNA expression profiles from the extinct woolly mammoth

本期推荐研究人员为破解灭绝古生物基因表达之谜，对晚更新世猛犸象开展古RNA（aRNA）测序研究，成功从39,000年前的标本中复原组织特异性转录谱，揭示肌肉代谢关键基因（如TTN、MYH7）及新型microRNA候选位点，填补了古转录组学空白，为整合古基因组、蛋白质组及转录组研究开辟新道路。

　　

在古遗传学研究领域，古代DNA（aDNA）技术已成功重构多种已灭绝物种的基因组，甚至重现了200万年前的古老生态系统。然而，DNA序列本身无法直接揭示组织的身份、基因表达的动态调节或转录调控机制——这些信息恰恰编码在RNA分子中。尽管古蛋白质组学能部分捕捉到蛋白质表达的信息，但RNA分子因其极易被RNase降解的特性，长期以来被认为难以在生物死亡后长期保存。因此，古RNA（aRNA）研究一直处于初步阶段，仅有少数研究从历史样本（如西班牙流感病毒）或近代动物标本中成功提取到RNA。

为了解决这一难题，爱米利奥·马尔莫尔-桑切斯（Emilio Marmol-Sanchez）及其合作团队在《Cell》杂志上发表了针对已灭绝真猛犸象的古RNA表达谱研究。他们从10个晚更新世的猛犸象组织样本（包括肌肉和皮肤）中成功提取并测序了aRNA分子，其中来自距今约39,000年前的“Yuka”猛犸象个体保存尤为完好，能够清晰解析其骨骼肌特异性转录模式。这项研究不仅刷新了古RNA保存年限的记录，还建立了一套完整的古转录组分析流程，涵盖从样本处理、测序策略到生物信息学验证的各个环节，为今后开展更广泛的古转录组研究奠定了方法论基础。

研究人员运用了多项关键技术：首先，对来自西伯利亚永久冻土保存的猛犸象组织进行总RNA提取，使用mirVana microRNA分离试剂盒优化流程；接着，利用NEXTFLEX small RNA-seq kit v3构建测序文库，并通过Bowtie2进行序列比对至亚洲象（mEleMax1）或猛犸象基因组；同时，开展宏基因组和宏转录组分析以评估样本内源性与污染情况；此外，还借助古DNA损伤模式分析、转录本定量、microRNA预测（miRDeep2）以及功能富集（GO term）等方法系统验证了aRNA数据的可靠性。

aRNA分子在猛犸象中保存完好

通过对10个猛犸象样本的DNA与RNA共提取与测序，只有3个样本（Yuka、Oymyakon和Chris Waddle）含有足够内源性的aRNA。地理分布与样本年代分析显示，这些样本来自西伯利亚东北部，时间跨度约39,000至52,000年。宏转录组分析表明，Yuka样本的Afrotheria类k-mer比例最高，RNA保存质量最佳。

古RNA序列显示剪接转录本的特征

研究人员开发了针对aRNA的优化比对策略，使用Bowtie2并设定最小读长18 nt，成功将序列比对至亚洲象参考基因组。结果表明，aRNA读长在古老样本中更短，且与外显子区域比对率更高，部分序列跨越了外显子-外显子连接区，说明其可能来源于成熟剪接的转录本。

Yuka实为XY雄性

尽管先前形态学鉴定认为Yuka是雌性，但通过aRNA和aDNA数据均检测到Y染色体基因（如USP9Y和SRY），基因型性别鉴定也支持其为雄性。这一发现揭示了表型与基因型性别之间的不一致性。

aRNA谱显示最小的DNA污染和GC偏好

与aDNA数据相比，aRNA数据中外显子区域显著富集，且DNA污染率极低（Yuka中仅为1.63%）。GC含量分析未发现明显的扩增偏倚，说明PCR过程未对转录本定量产生显著影响。

aRNA脱氨基模式类似单链古DNA

Yuka、Oymyakon和Chris Waddle的aRNA均呈现典型的C>U脱氨基损伤模式，与单链古DNA损伤特征一致，进一步支持了其古旧来源。

aRNA序列变异揭示猛犸象遗传特征

在Yuka的aRNA中，研究人员检测到猛犸象特有的单核苷酸变异（SNV），这些变异在与20个猛犸象基因组对比后得到验证。此外，还在microRNA（如Mir-1-P3）中发现了物种特异性变异。

利用aRNA数据预测新的microRNA位点

通过miRDeep2分析，研究人员从Yuka的aRNA数据中预测出两个新的microRNA候选位点（Mpr-Novel-4和Mpr-Novel-5），它们在长鼻目中具有高度保守性，可能参与基因转录后调控。

aRNA序列反映肌肉特异性转录组

Yuka的骨骼肌样本中高度表达的基因主要涉及肌肉代谢与结构功能，如肌联蛋白（TTN）、肌球蛋白重链（MYH6和MYH7）以及肌钙蛋白（TNNT1和TNNC1）等。这些基因的表达模式与现代人类骨骼肌高度相似，说明其转录组在数万年后仍能反映组织特异性。

这项研究的意义深远：它不仅证实了古RNA可以在永久冻土中保存超过4万年，还提供了首个灭绝物种的组织特异性基因表达图谱。这些发现突破了对RNA保存时间的传统认知，为未来整合古基因组学、古转录组学和古蛋白质组学研究提供了关键基础。从技术层面，该研究建立的分析框架（包括损伤分析、污染评估和转录本定量）将成为古RNA领域的标准流程。此外，所发现的肌肉特异性表达模式及新的调控RNA也为理解猛犸象的生物学适应和演化历史提供了分子证据。尽管古RNA研究仍处于起步阶段，但这项工作无疑打开了利用多组学方法探索远古生命奥秘的新大门。