中性粒细胞释放新型糖胺聚糖纤维结构——蛋白糖纤毛(PGF)的抗菌机制研究

《Cell Reports》：Proteoglycofili are glycosaminoglycan-containing fibrillar components released by neutrophils to neutralize bacteria

本刊推荐：为解决中性粒细胞在低氧或感染条件下如何发挥抗菌功能的问题，研究人员开展了关于新型纤维结构——蛋白糖纤毛(PGF)的研究。发现活中性粒细胞可释放不含DNA的PGF，其纤维结构由透明质酸(HA)和硫酸软骨素(CS)支撑，能靶向细菌并降解毒力因子，为炎症性疾病治疗提供新靶点。

　　

在人体免疫系统与病原体的永恒博弈中，中性粒细胞始终扮演着"先锋部队"的角色。这些活跃在炎症前沿的免疫细胞，传统上被认为通过吞噬、释放活性氧(ROS)和颗粒蛋白等方式消灭病原体。然而，在感染或肿瘤等病理微环境中，组织常常处于低氧状态，这给依赖氧气的抗菌机制带来了巨大挑战。特别是志贺菌(Shigella)等肠道病原体，能够主动消耗局部氧气，创造有利于自身存活的"感染性低氧"环境，从而规避中性粒细胞的常规攻击。

近年来，科学家们陆续发现了中性粒细胞释放的多种非溶性抗菌复合物，如中性粒细胞胞外陷阱(NETs)、外泌体和LC3依赖性细胞外囊泡等。其中，NETs作为DNA-蛋白质纤维网络的研究最为深入，但其形成伴随细胞死亡，且在低氧环境中受到抑制。这引出了一个关键科学问题：在低氧条件下，中性粒细胞是否拥有其他不依赖氧气的"秘密武器"来对抗病原体？

针对这一问题，由Benoit S. Marteyn领导的研究团队在《Cell Reports》上发表了突破性研究成果。他们发现了一种全新的中性粒细胞抗菌机制——活的中性粒细胞在低氧或细菌感染刺激下，能够释放一种不含DNA的纤维状结构，命名为"蛋白糖纤毛"(proteoglycofili, PGF)。这一发现不仅揭示了中性粒细胞抗菌策略的多样性，更为理解炎症性疾病的免疫调控开辟了新视角。

关键技术方法

研究团队采用多学科技术手段：通过缺氧工作站(^-O₂条件)培养人源中性粒细胞(来自健康志愿者外周血)，利用差速离心纯化PGF；扫描/透射电镜表征超微结构；蛋白质组学分析成分；免疫荧光/免疫金标记进行定位；特异性糖胺聚糖(GAG)水解酶处理验证功能；建立豚鼠志贺菌感染模型和Apc^lox/lox Cdx2-CreERT2^Tg/+结肠癌小鼠模型进行体内验证。

研究结果

中性粒细胞在体内外低氧条件下释放PGF

在感染志贺菌的豚鼠结肠黏膜中，研究人员首次观察到DNA自由的纤维结构，这些结构被中性粒细胞特异性标记物Myelotracker(靶向乳铁蛋白)染色，定位在感染灶周围的中性粒细胞附近。为探究其形成条件，团队在体外模拟低氧环境(^-O₂)培养人中性粒细胞，发现活细胞能持续释放被阿辛蓝和PAS染色的纤维材料，命名为PGF。扫描电镜显示单个PGF纤维直径约43.9±20.3 nm，可聚合形成更粗的纤维束。

重要的是，PGF释放伴随乳铁蛋白等颗粒蛋白的出现，表明脱颗粒过程发生，且释放细胞保持多叶核形态和活性，与NETs形成鲜明对比。定量成像分析证实PGF缺乏DAPI染色信号，且对DNase I不敏感，而对蛋白酶K敏感，进一步确认其非DNA本质。

PGF以颗粒蛋白为主要成分并承载细胞因子

纯化的PGF在宽pH和高盐条件下保持稳定。质谱分析揭示其蛋白质组成以颗粒蛋白为主，包括髓过氧化物酶、弹性蛋白酶、乳铁蛋白、抗菌肽cathelicidin和白蛋白。蛋白质印迹和免疫荧光在体内外验证了这些成分。同时，PGF富含TNF-α、IL-6和IL-8等细胞因子，提示其可能作为局部细胞因子富集平台。RNA测序显示PGF形成不依赖相关基因转录上调，表明其成分主要来自预存颗粒的释放。

PGF与NETs的明确区分

通过形态和生化特征对比，研究明确区分PGF与NETs：PGF由活细胞释放，无DNA，对DNase I不敏感；而NETs伴随细胞死亡，含DNA骨架。扫描电镜显示PGF释放细胞膜完整，而NETs形成细胞发生膜破裂。

PGF靶向志贺菌并抑制其毒力

在感染模型中，志贺菌优先诱导PGF而非NETs形成。PGF能直接结合细菌表面，包裹细胞外志贺菌。功能上，PGF展现选择性蛋白酶活性：在降解志贺菌毒力因子(IpaB/IpaC/IpaD等T3SS蛋白和IcsA等T5SS蛋白)的同时，不损伤宿主免疫蛋白(乳铁蛋白、IgG/IgA)。生长抑制实验显示PGF能阻断志贺菌、大肠杆菌和沙门氏菌的生长，且该活性在低氧条件下保持，热失活不影响抑菌但消除蛋白酶活性，提示非蛋白成分的关键作用。

GAGs是PGF结构与功能的核心

成分分析意外发现PGF富含两种糖胺聚糖(GAG)：透明质酸(HA)和硫酸软骨素(CS)。免疫荧光显示它们与乳铁蛋白在PGF中共定位。功能上，使用特异性水解酶(如降解HA和CS的Hyal. type I-S)处理可破坏PGF纤维结构并消除其抗菌活性，而单独降解HA或CS则效果不彰，表明二者协同维持PGF完整性。透射电镜免疫金标记进一步揭示，感染刺激中性粒细胞内形成HA/CS储存囊泡，并将其递送至细菌表面。

PGF在结肠癌模型中的广泛意义

在Apc^lox/lox Cdx2-CreERT2^Tg/+小鼠结肠炎性肿瘤中，研究人员同样检测到含HA/CS的PGF结构，表明其释放不仅限于感染背景，可能在肿瘤等慢性炎症中广泛存在。

结论与展望

本研究首次报道中性粒细胞能够释放GAG(HA和CS)，并揭示这些多糖是新型抗菌纤维PGF的结构与功能核心。PGF代表了一种独立于NETs的氧非依赖性抗菌机制，在低氧微环境中尤其重要。其通过GAG介导的细菌表面靶向和颗粒蛋白的协同作用，有效抑制病原体扩散。

这一发现具有多重意义：首先，它拓宽了对中性粒细胞免疫策略的认识，揭示其在低氧环境下通过PGF行使功能的适应性；其次，GAG在PGF中的核心作用提示其在炎症部位可能通过形成细胞因子梯度调控免疫细胞招募；最后，PGF在结肠癌模型中的出现表明其可能在肿瘤免疫微环境中发挥尚未知的功能。

尽管研究在固定方法和成分纯化方面存在局限，但无疑为理解炎症性疾病中中性粒细胞的作用开辟了新维度。未来研究将进一步探索PGF在不同疾病背景下的形成机制、免疫调控功能及其与其它中性粒细胞分泌物的相互作用，为开发新的炎症标志物和治疗策略奠定基础。