肌球蛋白Myo1c与Jagged1的机械敏感互作调控内皮细胞中Jag1的极性运输新机制

《iScience》：Mechanosensitive interactions between Jag1 and Myo1c control Jag1 trafficking in endothelial cells

本研究针对血流剪切力如何调控Notch配体Jagged1（Jag1）在内皮细胞中的定位这一关键问题，通过结合近距离标记技术与剪切力平台，首次发现肌球蛋白Myo1c是Jag1的机械敏感互作因子。研究表明，在静态条件下Myo1c与Jag1结合并维持其膜定位，而剪切力则削弱该互作并诱导Jag1向下游极性分布。Myo1c敲除不仅抑制剪切力诱导的Jag1极化，还降低静态条件下的膜Jag1水平。该发现揭示了Myo1c在心血管形态发生和疾病（如Alagille综合征）中调控Jag1运输的新机制，为理解机械生物学调控Notch信号提供了新视角。

　　

在心血管系统的发育过程中，内皮细胞能够感知血流动力学信号并做出响应，这一过程对血管的正常形态发生至关重要。Notch信号通路作为细胞间通讯的关键调控者，其配体Jagged1（Jag1）在血管生成和稳态维持中扮演着重要角色。Jag1的功能失调与多种心血管疾病相关，例如Alagille综合征、法洛四联症和动脉粥样硬化。然而，细胞如何精确调控Jag1在膜上的呈现和定位，尤其是在机械力刺激下，其分子机制尚不清晰。

为了揭示这一机制，Oscar M.J.A. Stassen等研究人员在《iScience》上发表了他们的最新研究成果。他们关注的核心问题是：内皮细胞在受到血流剪切力作用时，哪些分子伴侣与Jag1发生相互作用，从而调控其细胞内运输和空间分布？这一问题的答案对于理解心血管发育和疾病的力学基础具有重要意义。

研究人员采用了一种创新的组合策略：他们将工程化的抗坏血酸过氧化物酶（APEX2）与Jag1的C端胞内域融合，构建了Jag1-APEX2融合蛋白。这一工具能够在活细胞中，在过氧化氢和生物素酪酰胺存在下，对Jag1周围约20纳米范围内的蛋白质进行标记，即所谓的“近距离标记”。为了模拟体内的血流环境，他们使用了一种经过计算流体动力学优化的环形轨道摇床系统（“dish-in-a-dish”），该平台能够对内皮细胞施加均匀且可控的剪切应力（约0.6-0.8 Pa）。

通过对比静态、短时间（15分钟）和长时间（24小时）剪切应力条件下的标记结果，并进行质谱分析，研究人员筛选出了一系列Jag1的潜在相互作用蛋白。基因本体（GO）分析显示，这些蛋白富集于膜过程、细胞粘附和肌动球蛋白网络等相关功能。其中，肌球蛋白1c（Myo1c）引起了研究人员的特别关注。Myo1c是肌球蛋白I家族的成员，在膜张力调节、膜蛋白呈递和细胞间粘附稳定性中发挥作用，并且最近被报道参与剪切力诱导的血管性血友病因子（VWF）的分泌。

为了验证筛选结果，研究人员进行了免疫共沉淀（co-IP）实验。结果证实，在静态条件下，Myo1c确实与Jag1存在物理相互作用；而在施加24小时剪切应力后，这种相互作用显著减弱。反向的免疫共沉淀实验也观察到了类似的趋势，尽管统计学差异不显著。这初步表明Jag1与Myo1c的相互作用是机械敏感的。

那么，Jag1本身在剪切力作用下会发生怎样的变化呢？研究人员利用表达Jag1-eGFP的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行活细胞成像。他们观察到，在剪切力作用下，Jag1会迅速重新组织，聚集在细胞下游（即顺着剪切力方向的一侧），形成动态的亚结构。大约64%的细胞表现出这种Jag1的极性分布。有趣的是，在Jag1极化之后，细胞会沿着剪切力方向发生迁移。而在静态条件下，Jag1很少发生这样的重组，仅在细胞伪足回缩时偶有发生。进一步观察发现，Jag1在极化后会发生从膜向细胞核方向的运输。

接下来，研究人员开始探究Myo1c在Jag1重定位中的功能。他们首先使用了Myo1c的非竞争性可逆抑制剂五氯假连氮醇（PCLP）。用PCLP处理HUVEC细胞后，他们发现Jag1在核周区域发生了累积，且这种累积随着处理时间的延长而增加。然而，PCLP处理并未显著改变Jag1与Myo1c之间的相互作用，说明PCLP可能通过影响Myo1c的其他功能（如其马达活性）来发挥作用。值得注意的是，PCLP处理并未引起细胞骨架（肌动蛋白、微管蛋白、波形蛋白）的明显改变，这表明Jag1的核周累积并非简单的细胞形态变化所致。

为了更精确地评估Myo1c的功能，研究人员采用了小干扰RNA（siRNA）技术来敲低HUVEC细胞中的Myo1c表达。他们发现，在剪切力作用下，Myo1c敲低细胞失去了Jag1向下游极化的能力。这直接证明了Myo1c对于剪切力诱导的Jag1重定位是必需的。

更重要的是，通过细胞表面蛋白生物素化实验，研究人员量化了Jag1在细胞膜上的水平。他们发现，在静态条件下，敲低Myo1c会显著降低Jag1的膜水平。然而，在剪切力条件下，敲低Myo1c不仅没有降低膜Jag1水平，反而呈现出增加的趋势。这一看似矛盾的结果揭示了Myo1c功能的复杂性：在静态条件下，Myo1c可能参与将Jag1运输并锚定在质膜上；而在剪切力条件下，Myo1c功能的抑制（或其与Jag1互作的解离）可能反而促进了Jag1向特定膜区域的富集，或者影响了其内吞过程。综合这些发现，研究人员提出了一个工作模型：在静态条件下，Myo1c与Jag1结合，帮助其维持在质膜上；当剪切力作用于细胞时，这种相互作用减弱，从而允许Jag1发生极化分布，并可能被运输到不同的细胞区室以执行其信号功能。

本研究主要应用了以下几种关键技术方法：利用APEX2近距离生物素标记技术结合质谱分析来鉴定在剪切力条件下与Jag1相互作用的蛋白质；使用计算流体动力学优化的环形轨道摇床系统对内皮细胞施加可控的剪切应力；通过免疫共沉淀验证蛋白质间的直接相互作用；采用活细胞成像技术观察Jag1-eGFP在剪切力下的动态分布；利用siRNA敲低和药理学抑制剂（PCLP）来研究Myo1c的功能；并通过细胞表面蛋白生物素化实验定量分析Jag1的膜定位水平。研究所用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）为商品化购买的混合供体来源细胞系。

Jag1 polarizes downstream of flow followed by nucleograde transport from the membrane

研究人员首先确认了Jag1在内皮细胞中对剪切力的响应。他们将HUVEC细胞置于可产生1.8 Pa剪切应力的流动腔系统中，发现与静态条件相比，长达48小时的剪切力处理诱导Jag1发生显著的重组和极化。大多数细胞（64%）中的Jag1蛋白聚集在细胞的下游区域。活细胞成像进一步揭示，Jag1首先在细胞下游边缘快速累积，随后这些Jag1簇会向细胞核方向移动。在Jag1极化之后，内皮细胞本身也倾向于沿着剪切力方向迁移。

Jag1-APEX2 identified shear-sensitive interactors

为了寻找调控Jag1运输的机械敏感因子，研究人员构建了Jag1-APEX2融合蛋白，并将其在HUVEC中表达。他们在静态、15分钟剪切和24小时剪切三种条件下进行了APEX2介导的近距离标记。质谱分析结果鉴定出了一系列在不同条件下与Jag1邻近的蛋白质。通过对比不同条件，他们发现肌球蛋白Myo1c在静态条件下与Jag1邻近，而在剪切应力下这种邻近关系消失，提示Myo1c可能是Jag1的一个机械敏感相互作用因子。

Myo1c interacts with and regulates Jag1 localization

此部分研究对Myo1c与Jag1的相互作用及其功能后果进行了深入验证。免疫共沉淀实验证实，在静态条件下Myo1c与Jag1存在物理结合，而24小时剪切应力处理则减弱了这种结合。使用Myo1c抑制剂PCLP处理细胞，虽然不直接影响两者的结合，但引起了Jag1在核周区域的累积，暗示Myo1c功能抑制扰乱了Jag1的正常运输。更重要的是，通过siRNA敲低Myo1c，研究人员发现剪切力诱导的Jag1极化现象被抑制了。细胞表面生物素化实验进一步揭示，Myo1c敲低在静态条件下降低了Jag1的膜水平，而在剪切条件下则表现出增加膜Jag1水平的趋势。这些结果共同表明，Myo1c在调控Jag1的膜呈现和剪切力诱导的重定位中扮演着复杂而关键的角色。

本研究首次揭示了Myo1c作为Jag1的一个新型机械敏感相互作用伙伴，在内皮细胞响应血流动力学刺激过程中调控Jag1的运输和定位。研究结果表明，Myo1c与Jag1的相互作用在静态条件下有助于Jag1在质膜上的稳定存在，而剪切力则通过削弱这种相互作用，促使Jag1发生极性分布和核向运输，这可能与其作为Notch信号通路配体的功能激活密切相关。该发现不仅深化了对Notch信号通路机械调控机制的理解，也将Myo1c的功能与心血管发育性疾病（如Alagille综合征，其病理特征包括JAG1基因突变导致的胆管和心脏异常）联系起来。尽管Myo1c本身尚未被直接关联到先天性心脏缺陷，但其在调控Jag1等关键形态发生素运输中的作用提示它可能间接影响心脏形态发生。此外，研究结果暗示Myo1c可能通过调节Jag1和VEGFR2等膜受体的呈递，在血管生成中发挥更广泛的作用。未来研究需要进一步阐明Myo1c精确调控Jag1运输和信号输出的分子机制，以及这种调控在生理和病理条件下的重要意义。本研究为探索机械生物学如何整合于发育和疾病信号网络提供了新的视角和实验依据。