蝙蝠洞环境中挥发性有机化合物对Pseudogymnoascus destructans的体外抑制机制

《Applied and Environmental Microbiology》：Mechanisms of volatile organic compounds from bat cave environments against Pseudogymnoascus destructans in vitro

本研究筛选出蝙蝠洞穴环境中具有抗真菌活性的两种挥发性有机化合物2,5-二甲基环己醇（DMCH）和非anal，通过扫描电镜、透射电镜及转录组、代谢组学分析，揭示其通过破坏细胞壁和膜结构、诱导细胞凋亡、增强氧化应激、干扰能量代谢及MAPK信号通路等机制抑制Pseudogymnoascus destructans生长，为白鼻病生态防控提供新策略。

　　白鼻综合症（White-nose syndrome, WNS）是一种由嗜冷真菌*Pseudogymnoascus destructans*（Pd）引发的野生动物疾病，主要影响在冬季休眠期间的蝙蝠种群。自2006年以来，该病已在北美地区造成数百万只蝙蝠死亡，并对多个蝙蝠物种构成了严重威胁。尽管WNS在北美地区对蝙蝠种群造成了毁灭性影响，但在中国某些地区，蝙蝠似乎未受到显著影响，感染的Pd数量较少，甚至没有报告死亡案例。这种差异可能与蝙蝠的免疫系统、皮肤微生物群产生的活性物质或环境条件限制了Pd孢子与蝙蝠的接触有关。因此，研究蝙蝠栖息地中的其他微生物或化合物是否能够与Pd竞争资源或抑制其生长，对于理解WNS的生态学和开发有效的防控措施具有重要意义。

VOCs（挥发性有机化合物）作为潜在的抗真菌剂，近年来在对抗Pd方面展现出良好的前景。VOCs可以影响真菌的生长、形态和致病性，其作用机制可能包括破坏细胞壁和细胞膜、诱导氧化应激和细胞凋亡、干扰代谢途径以及改变细胞结构等。尽管已有研究探讨了VOCs对Pd的抑制效果，但其具体作用机制仍不明确。本研究旨在揭示来自蝙蝠洞穴环境中的VOCs如何影响Pd的生长，并通过整合生理生化实验、转录组和代谢组分析，全面解析这些化合物的抗真菌作用机制。

研究团队从中国东北地区的三个蝙蝠洞穴中收集了土壤和空气样本，并利用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）检测其中的VOCs。共鉴定了272种VOCs，其中40种相对丰度超过1%。通过非参数多元方差分析（PERMANOVA）和非度量多维尺度分析（NMDS）发现，不同样本类型（土壤与空气）以及不同洞穴之间的VOCs组成存在显著差异。在这些VOCs中，2,5-二甲基环己醇（DMCH）和壬醛（nonanal）表现出最强的抗Pd活性，并在多个样本中均被检测到。这些化合物的最小抑菌浓度（MIC）和半数抑菌浓度（IC50）分别为0.02 μL/mL和0.55 μL/mL，以及0.006 μL/mL和0.36 μL/mL。这些数据表明DMCH和nonanal具有显著的抗真菌潜力。

为了进一步研究这些VOCs对Pd的影响，研究团队通过扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观察了DMCH和nonanal处理后的Pd菌丝形态和超微结构。结果显示，未经处理的Pd菌丝呈现饱满、光滑和规则的形态，而DMCH和nonanal处理后的菌丝则出现收缩、扭曲和断裂，部分菌丝甚至出现细胞内容物泄漏的现象。这些结果表明，DMCH和nonanal可能通过破坏Pd的细胞壁和细胞膜结构来抑制其生长。

在细胞凋亡和氧化应激方面，研究团队利用Annexin V-FITC/PI双染色和DCFH-DA探针检测了VOCs对Pd菌丝的影响。结果显示，DMCH和nonanal处理后的菌丝表现出更高的绿色（Annexin V-FITC）和红色（PI）荧光信号，表明这些化合物可能通过诱导细胞凋亡来抑制Pd的生长。同时，DCFH-DA荧光强度的增加也表明处理后的菌丝中氧化应激水平升高，进一步支持了VOCs通过诱导氧化应激来抑制Pd的机制。

为了全面了解VOCs对Pd的影响，研究团队还进行了生化分析。结果表明，DMCH和nonanal处理后的Pd菌丝中，超氧阴离子含量显著增加，而超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性则显著降低。此外，ATP含量在处理后的菌丝中有所上升，这可能与细胞凋亡过程中ATP的消耗有关。这些生化变化进一步揭示了VOCs对Pd代谢和应激反应的影响。

通过转录组分析，研究团队鉴定了DMCH和nonanal处理后的Pd菌丝中差异表达的基因（DEGs）。结果显示，DMCH处理组中有2,076个DEGs，其中728个基因表达上调，1,348个基因表达下调；nonanal处理组中有1,460个DEGs，其中390个基因上调，1,070个基因下调。这些DEGs主要涉及细胞壁合成、氧化应激响应、能量代谢和信号传导等关键生物学过程。例如，与细胞壁合成相关的基因如*CHS1*和*CHS7*在处理后显著下调，表明VOCs可能通过干扰细胞壁的合成和结构完整性来抑制Pd的生长。此外，与能量代谢相关的基因如ATP合成酶复合物V的基因也表现出显著上调，这可能与细胞凋亡过程中ATP的生成有关。

代谢组分析进一步揭示了VOCs对Pd代谢途径的影响。结果显示，DMCH和nonanal处理后，Pd菌丝中多种代谢物发生显著变化，包括氨基酸代谢、ABC转运体相关代谢物以及糖代谢相关代谢物的改变。这些变化表明，VOCs可能通过干扰Pd的代谢途径，影响其适应性和致病性。例如，某些氨基酸的合成受到抑制，而ABC转运体的活性则有所增强，这可能与细胞膜渗透性和稳态维持有关。

综合转录组和代谢组分析，研究团队还发现，DMCH和nonanal处理后的Pd菌丝中，与氧化应激相关的基因和代谢物显著上调，而与细胞膜稳定性和抗氧化相关的基因和代谢物则显著下调。这些结果表明，VOCs可能通过增强电子传递链（ETC）的活性，促进超氧阴离子的生成，从而诱导氧化应激，导致细胞损伤和死亡。此外，研究团队还发现，DMCH和nonanal处理后，Pd菌丝中与MAPK信号通路相关的基因表达显著下调，这可能影响其细胞周期调控和致病性。

研究结果表明，DMCH和nonanal通过多种机制抑制Pd的生长。首先，它们破坏了Pd的细胞壁和细胞膜结构，导致细胞内容物泄漏和形态异常。其次，它们通过诱导细胞凋亡，影响Pd的生存和繁殖能力。此外，它们还通过干扰能量代谢，特别是TCA循环和氧化磷酸化（OXPHOS）过程，导致Pd无法维持正常的能量供应，从而影响其生长和致病性。最后，它们通过增强氧化应激，抑制Pd的抗氧化能力，进一步促进其细胞损伤和死亡。

本研究的发现为VOCs在对抗白鼻综合症方面提供了新的科学依据。通过理解这些化合物的作用机制，可以为开发基于VOCs的生物控制策略提供理论支持。未来的研究应关注VOCs在自然环境中的浓度、释放方式以及对蝙蝠及其生态环境的影响，以确保其在实际应用中的安全性和有效性。此外，还需要进一步探索VOCs在不同蝙蝠种群中的适用性，以及它们在长期应用中的生态影响，从而为保护蝙蝠种群和维护生态系统的健康提供更全面的解决方案。