霰弹枪宏基因组挖掘技术在等足类动物肠道微生物组中发现了一种新的依赖FAD的D-乳酸脱氢酶

《Applied and Environmental Microbiology》：Shotgun metagenomic mining reveals a new FAD-dependent D-lactate dehydrogenase in an isopod gut microbiome

本研究通过宏基因组测序发现并表征了蚕豆蚤肠道微生物中的一种新型FAD依赖性D-乳酸脱氢酶（PdG-D-LDH）。该酶具有高温稳定性（最适温度50-55℃）、高催化效率（D-乳酸氧化周转率8.2 s?1）及立体选择性，其晶体结构显示含FAD和Fe2?的活性位点，并通过计算模拟揭示了D-乳酸与酶的相互作用机制。该酶在氧气存在下可高效将D-乳酸转化为丙酮酸（产率90%），为生物催化生产高附加值化合物提供了新途径。

　　这项研究通过宏基因组测序、结构生物学和计算工具的综合应用，成功从土壤食性等足目动物 *Porcellio dilatatus* 的肠道微生物组中发现了一种新的依赖黄素的 D-乳酸脱氢酶（PdG-D-LDH）。该酶具有重要的生物催化潜力，能够高效地将 D-乳酸氧化为丙酮酸，并且表现出热稳定性、立体选择性和高催化效率等特性，这使其在生物技术领域具有广阔的应用前景。以下是对该研究的详细解读。

### 一、研究背景与意义

乳酸是自然界中最丰富的 α-羟酸之一，广泛存在于生物体内，并在细胞代谢中扮演关键角色。它在食品、化妆品、制药和化学工业中有着重要的应用价值，尤其是在生物可降解材料如聚乳酸（PLA）的生产中。PLA 作为一种具有优异机械性能和热稳定性的生物聚合物，其生产依赖于 D-乳酸的高效合成。然而，传统的化学合成方法通常涉及高温、高压和有毒试剂，这不仅对环境造成负担，还增加了生产成本。

近年来，通过糖发酵生产乳酸的方法逐渐受到关注，特别是使用乳酸菌进行生物合成。这种方法不仅更环保，还能实现对乳酸立体异构体的选择性控制。D-乳酸和 L-乳酸的立体选择性对产物的性能至关重要，其中 D-乳酸在 PLA 的合成中具有更高的优势。因此，寻找能够高效催化 D-乳酸氧化为丙酮酸的酶，对于实现可持续的生物催化过程具有重要意义。

在生物催化过程中，酶的热稳定性是其能否应用于工业反应的关键因素之一。由于许多工业反应条件较为苛刻，如高温和高压，酶的热稳定性直接影响其在实际应用中的效率和成本。此外，许多生物催化反应需要使用分子氧作为电子受体，这种条件通常要求酶具备较高的氧化能力，同时保持结构的完整性。因此，研究具有热稳定性和高催化效率的酶，是推动生物技术发展的重要方向。

### 二、研究方法与技术

本研究采用了一种多学科融合的方法，结合宏基因组测序、结构生物学和计算工具，对 *P. dilatatus* 肠道微生物组进行深入分析。首先，研究人员从 *P. dilatatus* 的肠道中提取了基因组 DNA，并利用 Illumina 平台进行了霰弹式宏基因组测序。测序后，通过质量控制，获得了 93,710,998 条高质量的配对末端读数，最终组装成 29,215 条 contigs，总长度为 49,584,674 bp。这些 contigs 被用来生成蛋白序列，经过质量筛选后，获得了 63,409 条蛋白序列。

接下来，研究人员对这些蛋白序列进行了功能注释和分类，其中 49% 的序列被归类为与代谢功能模块相关，而其中 26% 与碳水化合物代谢有关。这表明 *P. dilatatus* 肠道微生物组在碳水化合物代谢方面具有丰富的酶资源，这为后续发现新的代谢酶提供了坚实的基础。

在酶的发现过程中，研究人员使用了 BLAST 和 AlphaFold3 等计算工具，对已知的 D-乳酸脱氢酶（如小鼠和 *Acetobacterium woodii* 的结构）进行比对，筛选出具有相似序列的候选蛋白。最终，他们确定了一种名为 PdG-D-LDH 的新蛋白，并通过重组表达技术在 *E. coli* 中实现了其表达和纯化。

### 三、酶的特性与功能

PdG-D-LDH 是一种由两个相同亚基组成的同源二聚体，表现出热活性和热稳定性。在实验中，该酶在 50–55°C 时达到最大活性，且在 25°C 时仍能保留 60% 的活性，这表明其在高温条件下的稳定性优于许多已知的 D-乳酸脱氢酶。此外，PdG-D-LDH 在 60°C 下的半衰期约为 3.7 小时，表明其在工业反应中的应用潜力。

在底物选择性方面，PdG-D-LDH 对 D-乳酸表现出显著的偏好，其催化效率（k_cat/K_m）是 L-乳酸的 2 到 3 个数量级。这一特性对于选择性生产 D-乳酸至关重要。在使用不同的电子受体（如 DCIP、1,4-苯醌、NQS、细胞色素 c 和分子氧）进行实验时，PdG-D-LDH 对 1,4-苯醌的催化效率远高于对细胞色素 c 和分子氧的效率，这表明其作为脱氢酶的活性优于作为氧化酶的活性。

此外，PdG-D-LDH 的活性位点具有独特的结构特征，包括一个溶剂可及的活性腔，其中含有黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和 Fe(II) 离子。这种结构特征不仅有助于酶的稳定性，还为其催化活性提供了基础。分子对接研究进一步揭示了该酶的立体选择性底物识别机制，表明其对 D-乳酸的识别主要依赖于特定的氢键和疏水相互作用。

在催化反应中，PdG-D-LDH 能够在温和的条件下将 D-乳酸氧化为丙酮酸，反应 24 小时后丙酮酸的产率高达 90%。这一结果远高于文献中报道的其他 D-乳酸脱氢酶的产率（最高仅为 50%），表明 PdG-D-LDH 在生物催化过程中具有显著的优势。然而，在使用 1,4-苯醌作为电子受体时，反应过程中产生了大量的乙酸，这可能是因为酶在某些条件下表现出氧化酶的活性，而非脱氢酶的活性。

### 四、结构与功能关系

PdG-D-LDH 的结构研究揭示了其与已知 D-乳酸脱氢酶（如小鼠和 *Acetobacterium woodii*）之间的相似性，同时也显示出一些独特的结构特征。例如，其 FAD 结合域的结构与小鼠 D-乳酸脱氢酶（PDB 8JDE）最为接近，具有 1.57 ? 的 RMSD 值，而与 *Acetobacterium woodii* 的结构（PDB 7QH2）则稍远（1.91 ?）。这表明 PdG-D-LDH 可能是小鼠 D-乳酸脱氢酶的一个近亲，同时也与细菌来源的 D-乳酸脱氢酶存在一定的差异。

在活性位点的结构分析中，研究人员发现 PdG-D-LDH 的活性腔具有较大的体积和面积（314.6 ?3 和 490.5 ?2），这可能与其高催化效率有关。活性位点的保守残基，如 E31、T73、H378 和 H416，可能在催化过程中起到关键作用。此外，PdG-D-LDH 的底物结合域和 C 端结构域也显示出特定的结构特征，这可能与其在微生物代谢中的功能密切相关。

在催化机制方面，PdG-D-LDH 的活性位点通过特定的氢键和疏水相互作用稳定 D-乳酸，并促进其与 FAD 的相互作用。研究还发现，D-乳酸的 C2-OH 原子距离 FAD 的 N5 原子约为 4.6 ?，这一距离在催化效率方面可能不够理想，而小鼠 D-乳酸脱氢酶的相应距离仅为 3.1 ?。这表明 PdG-D-LDH 的催化几何结构可能不如小鼠酶那样理想，但其通过其他结构特征（如疏水相互作用）弥补了这一不足，从而实现了较高的催化效率。

### 五、应用前景与研究价值

PdG-D-LDH 的发现为生物催化领域提供了一个新的工具，特别是在 D-乳酸的高效氧化和丙酮酸的生产方面。由于其具有热稳定性和高催化效率，该酶在工业反应中可能具有较大的应用潜力。此外，其对 D-乳酸的立体选择性，使其在生物可降解材料的生产中具有独特的优势，尤其是在 PLA 的合成过程中。

从生态和经济角度出发，PdG-D-LDH 的发现支持了循环经济理念的应用。随着微生物生产 D-乳酸技术的不断发展，特别是利用木质纤维素废弃物进行生产，D-乳酸的成本有望大幅降低，从而提高 PdG-D-LDH 在生物催化过程中的经济可行性。此外，该酶的高催化效率和选择性，使其成为研究微生物代谢和生物催化机制的重要对象。

在结构生物学研究方面，PdG-D-LDH 的发现填补了 FAD 依赖型 D-乳酸脱氢酶结构信息的空白。目前，仅有八种此类酶的 X 射线晶体结构被收录在蛋白质数据库（PDB）中，而 PdG-D-LDH 的结构为理解这类酶的结构-功能关系提供了新的视角。通过比较其结构与已知酶的结构，研究人员能够更深入地了解其催化机制和适应性特征。

此外，PdG-D-LDH 的发现也展示了宏基因组技术在挖掘新型生物催化剂方面的强大潜力。通过宏基因组测序，研究人员能够在复杂的微生物环境中快速识别具有潜在应用价值的酶。这种技术不仅提高了研究效率，还扩大了可研究的酶的范围，为未来发现更多新型生物催化剂提供了可能性。

### 六、研究局限与未来方向

尽管 PdG-D-LDH 在催化效率和热稳定性方面表现出色，但其在某些条件下的活性仍存在局限性。例如，在使用 1,4-苯醌作为电子受体时，酶的活性受到抑制，这可能与其对电子受体的特异性有关。因此，未来的研究可以探索如何通过酶工程手段提高其对不同电子受体的适应性，以扩大其在生物催化中的应用范围。

此外，PdG-D-LDH 的活性位点中包含 Fe(II) 离子，这可能与其在特定环境中的适应性有关。然而，该酶对 Fe(II) 的依赖性是否会影响其在不同条件下的稳定性，仍需进一步研究。未来的研究可以探索是否可以通过其他金属离子（如 Mn2?）来增强其催化活性或稳定性，这可能为优化其在工业应用中的性能提供新的思路。

最后，PdG-D-LDH 的研究也揭示了微生物在特定生态位中可能具备的独特的代谢适应性。通过比较其与已知酶的结构和功能，研究人员能够更好地理解微生物代谢的多样性，并为开发新的生物催化剂提供理论支持。未来，结合更多结构生物学和计算生物学技术，有望进一步揭示此类酶的催化机制和进化路径，从而推动其在生物技术中的应用。

### 七、结论

本研究通过宏基因组测序和结构生物学技术，成功从 *P. dilatatus* 的肠道微生物组中发现了一种新的 FAD 依赖型 D-乳酸脱氢酶 PdG-D-LDH。该酶在催化 D-乳酸氧化为丙酮酸方面表现出优异的性能，具有热活性和热稳定性，以及对 D-乳酸的立体选择性。这些特性使其在生物技术领域具有广阔的应用前景，尤其是在生物可降解材料的生产中。

PdG-D-LDH 的发现不仅拓展了 D-乳酸脱氢酶的已知种类，还为理解这类酶的结构-功能关系提供了新的数据。此外，该研究展示了如何通过宏基因组测序、结构生物学和计算工具的结合，加速新型生物催化剂的发现和开发。未来，通过进一步的酶工程和代谢研究，有望将 PdG-D-LDH 应用于更广泛的生物催化过程，推动可持续工业的发展。