衣原体（Chlamydia trachomatis）ObgE基因的异位过表达以及基于CRISPRi技术的敲低能够抑制RB的复制和EB结构的重组

《Journal of Bacteriology》：Ectopic overexpression and CRISPRi-based knockdown of Chlamydia trachomatis ObgE inhibits RB replication and EB reformation

沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）的ObgE蛋白在发育周期中起关键作用：过表达导致感染性EBs生成减少，而敲低则显著抑制细菌复制和包涵体发育，并上调衣原体III型分泌系统（T3SS）相关基因表达。

　　### 了解与解析：ObgE在沙眼衣原体发育周期中的作用

沙眼衣原体（*Chlamydia trachomatis*）是一种重要的专性细胞内寄生菌，其感染可导致严重的临床后果，包括性传播感染引发的盆腔炎和不孕，以及眼部感染导致的失明疾病——沙眼。这种细菌的生命周期中，存在两种关键形态：非复制性的感染性原体（elementary body, EB）和复制性的非感染性网状体（reticulate body, RB）。在感染过程中，沙眼衣原体需要在EB和RB之间进行形态转换，以完成其在宿主细胞内的增殖与传播。

ObgE是一种高度保守的GTP酶，其在其他细菌中已被证实与形态分化有关。在沙眼衣原体中，*obgE*基因在感染后16至24小时表达达到峰值，这与沙眼衣原体的对数生长期及感染性原体的重新形成时间相吻合。因此，ObgE可能在沙眼衣原体的复制及形态转换过程中发挥重要作用。为了进一步探索ObgE在沙眼衣原体生命周期中的具体作用，本研究通过两种方法：外源性过表达和CRISPRi介导的基因敲低，分析其对RB复制和EB形成的潜在影响。

#### 外源性过表达ObgE对感染性原体生成的影响

在本研究中，通过构建带有外源性ObgE-3xFLAG的表达载体，将该基因导入沙眼衣原体L2/434/Bu菌株，以实现ObgE的过表达。同时，为了确保实验结果的可靠性，还构建了一个以Clover为标记的对照载体，用于排除因外源蛋白表达带来的非特异性影响。研究结果显示，当ObgE被过表达时，感染性原体的生成量显著减少，但细菌的超微结构并未发生明显变化。这表明，尽管ObgE的过表达不影响RB向EB的形态转换过程，但其对感染性原体的形成和功能产生了负面影响。具体而言，ObgE的过表达导致在24小时和45小时感染时间点，感染性原体的回收率分别下降了90%和83%。这提示我们，ObgE在EB形成过程中可能扮演着重要角色，尤其是在某些关键基因的表达调控方面。

#### ObgE的过表达未改变细菌的超微结构

为了进一步验证ObgE对细菌形态转换的影响，研究团队利用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）观察了感染过程中细菌的超微结构变化。结果显示，即使在ObgE过表达的情况下，细菌的形态和数量并未发生明显变化。这说明ObgE的过表达可能并不直接影响RB向EB的形态转变过程，而是通过调控某些关键基因的表达，间接影响了感染性原体的功能。例如，ObgE的过表达显著降低了*hctB*基因的表达，而*hctB*基因与EB的形成密切相关。这表明ObgE可能通过调控基因表达，影响感染性原体的生成与感染能力。

#### ObgE的过表达影响EB相关T3SS基因的表达

沙眼衣原体的T3SS（III型分泌系统）在感染过程中起着至关重要的作用，其分泌的效应蛋白对于细菌的入侵、在宿主细胞内建立感染和调节宿主-病原体相互作用至关重要。研究发现，ObgE的过表达显著降低了*tarp*和*scc2*等与EB相关的T3SS基因的表达。*tarp*是最早被分泌的效应蛋白之一，负责招募宿主来源的肌动蛋白到入侵位点，这对于EB的形成和感染过程至关重要。*scc2*则是一种T3SS的伴侣蛋白，帮助折叠和稳定转运蛋白。因此，ObgE的过表达可能通过抑制这些关键基因的表达，影响EB的功能，从而导致感染性原体的减少。

#### ObgE的敲低对沙眼衣原体复制和感染性原体生成的影响

为了探讨ObgE在沙眼衣原体生命周期中的必要性，研究团队采用了CRISPRi技术对*obgE*基因进行敲低。通过构建一个带有dCas12蛋白和靶向*obgE*基因的gRNA的表达载体，实现了对*obgE*的基因表达抑制。结果显示，当*obgE*被敲低时，细菌的产量（genome equivalents, GE）和感染性原体的回收率（inclusion forming units, IFUs）均显著下降，甚至减少了约2个数量级。这表明*obgE*基因在沙眼衣原体的复制和EB形成过程中起着关键作用。此外，敲低*obgE*还导致了在25小时感染时间点，与RB相关的T3SS基因如*euo*、*incA*、*incD*和*cpoS*的表达显著增加。这些基因在RB的复制和包含体的发育中起着重要作用，因此*obgE*的敲低可能通过调控这些基因的表达，间接影响了RB的复制和EB的形成。

#### ObgE的表达平衡对沙眼衣原体发育周期的重要性

综合上述实验结果，可以得出结论：ObgE在沙眼衣原体的发育周期中扮演着重要角色。其过表达导致感染性原体的生成减少，而其敲低则显著抑制RB的复制和EB的形成。这些结果表明，ObgE的表达水平必须保持在一个适当的范围内，才能支持沙眼衣原体的正常生命周期。ObgE可能通过调控特定基因的表达，影响细菌的复制和形态转换过程。例如，ObgE的过表达导致*hctB*和*T3SS*相关基因的表达异常，而其敲低则影响了*euo*等RB相关基因的表达。这种复杂的调控网络表明，ObgE在沙眼衣原体的感染过程中可能具有多重功能。

#### ObgE在沙眼衣原体中的功能推测

尽管ObgE在沙眼衣原体中的具体功能尚不明确，但其在其他细菌中的作用为理解其在沙眼衣原体中的功能提供了线索。例如，在大肠杆菌中，ObgE参与染色体分离、复制调控、核糖体成熟和严格反应的调节。在沙眼衣原体中，ObgE可能通过影响核糖体的合成或功能，进而影响细菌的复制和EB的形成。此外，ObgE可能通过与其他蛋白质的相互作用，调节关键基因的表达，从而影响整个发育周期。

#### 实验方法与技术细节

本研究采用了一系列先进的实验方法和技术手段，以确保结果的准确性和可靠性。首先，利用基因工程手段构建了带有外源性ObgE-3xFLAG的表达载体，并通过Western blot和免疫荧光分析验证了其表达。其次，通过CRISPRi技术实现了*obgE*的基因敲低，并利用qPCR分析了基因表达的变化。此外，利用透射电子显微镜观察了感染过程中细菌的超微结构变化，以评估ObgE对形态转换的影响。这些实验方法的综合应用，为理解ObgE在沙眼衣原体生命周期中的作用提供了坚实的基础。

#### 结论与意义

综上所述，ObgE在沙眼衣原体的生命周期中起着至关重要的作用。其过表达导致感染性原体的生成减少，而其敲低则显著抑制RB的复制和EB的形成。这些结果表明，ObgE的表达必须保持在适当的水平，才能支持沙眼衣原体的正常发育和感染过程。进一步的研究将有助于揭示ObgE的具体功能及其在沙眼衣原体感染中的分子机制，为开发新的治疗策略提供理论依据。