CanID-PCR：一种快速且低成本的PCR技术，可直接从阳性血液样本中提取的gDNA上来鉴定念珠菌种类

《Microbiology Spectrum》：CanID-PCR: a quick and low-cost PCR tool to identify Candida species on gDNA directly extracted from positive blood bottles

Candida血流感染的高死亡率及抗真菌耐药物种（如Candida auris和C. glabrata）的增多，促使开发快速直接从阳性血培养瓶提取DNA的PCR工具CanID-PCR。该工具利用ACT1基因变长内含子区分九种常见念珠菌，在8小时内完成物种鉴定，无需额外培养，设备要求低，并成功检测到临床实验室遗漏的C. fabianii及混合感染。

在临床医学中，真菌感染尤其是念珠菌（Candida）引起的血流感染（bloodstream infection, BSI）是一种严重的疾病，具有较高的死亡率。随着医学技术的进步，传统的微生物学检测方法虽然在一定程度上能够识别这些病原体，但其耗时长、成本高以及在某些情况下准确性不足，已成为临床实践中的一大挑战。尤其是在处理复杂的混合感染时，传统方法往往因只分析少量菌落而遗漏部分病原体，进而影响治疗方案的选择。为了应对这一问题，研究团队开发了一种基于聚合酶链式反应（PCR）的快速检测工具——CanID-PCR，它能够在不依赖额外培养的情况下，直接从阳性血培养瓶中快速、准确地鉴定念珠菌的种类。这种技术不仅降低了检测成本，还提高了检测效率，为临床诊断和科研工作提供了新的可能性。

CanID-PCR的核心原理在于利用了ACT1基因中的可变长度内含子。这一基因在不同念珠菌种类中表现出显著的长度差异，使得通过PCR扩增后产生的条带大小可以用于区分多种常见念珠菌种类。研究人员设计了针对九种主要念珠菌种类的特异性正向引物和通用的反向引物，通过将这些引物组合成等摩尔的引物混合物，实现了对不同种类的高效检测。这种方法的最大优势在于其无需进行额外的培养步骤，仅需从血培养瓶中提取基因组DNA，并利用标准的实验室设备进行PCR扩增和凝胶电泳分析，即可在大约8小时内完成检测。这种快速检测手段对于需要及时诊断和治疗的患者来说尤为重要，尤其是在资源有限的医疗机构或需要迅速响应的临床场景中。

在实验过程中，研究人员使用了64份来自不同患者的阳性血培养样本进行测试。结果显示，CanID-PCR在99%的情况下与临床微生物实验室的鉴定结果一致，显示出极高的准确性。然而，该方法仍存在一些局限性。例如，它无法区分C. parapsilosis和C. metapsilosis这两个高度相似的物种，因为它们在基因层面的差异较小。此外，在一个混合感染样本中，CanID-PCR检测到了C. tropicalis，而临床实验室未能识别该物种，这可能是因为在厌氧条件下C. tropicalis的生长受限，导致无法从培养瓶中分离出来。这些发现表明，CanID-PCR不仅能够准确识别单种念珠菌感染，还能够在某些情况下发现传统方法可能忽略的混合感染。

在实际应用中，CanID-PCR的优势尤为突出。首先，它避免了传统的微生物培养流程，缩短了整体检测时间。传统的检测流程通常需要24小时以上的时间来培养菌落并进行后续的鉴定，而CanID-PCR能够在8小时内完成检测，为临床医生提供了更及时的诊断信息。其次，该方法的设备要求较低，仅需基本的分子生物学设备，如PCR仪和凝胶电泳系统，而无需昂贵的专用仪器，如MALDI-TOF MS。这使得CanID-PCR在资源有限的实验室或研究机构中具有较高的可行性。此外，CanID-PCR的检测成本相对较低，每份检测的耗材费用约为5至8美元，相较于其他高成本的分子检测方法，如商用多重PCR平台，其经济性更加显著。

尽管CanID-PCR表现出色，但它并不能完全取代现有的高通量检测技术。例如，MALDI-TOF MS作为一种快速、准确的检测手段，已经在许多临床实验室中被广泛应用。它能够通过质谱分析快速鉴定微生物种类，尤其适用于已经获得纯培养的样本。然而，MALDI-TOF MS的设备投资成本较高，通常需要数十万美元的初始投入，加上每年的维护费用，这对于资金有限的医疗机构来说可能是一个负担。相比之下，CanID-PCR的使用门槛更低，更适合于需要快速检测但无法负担高成本设备的环境。

在实际应用中，CanID-PCR的检测结果可以作为临床实验室的补充工具。例如，在处理混合感染样本时，CanID-PCR能够检测到多个念珠菌种类，而传统方法可能因只分析部分菌落而遗漏某些物种。这一特点对于识别具有不同抗真菌药物敏感性的混合感染尤为重要。例如，某些念珠菌种类对唑类抗真菌药物具有耐药性，而其他种类则可能对这些药物敏感。在治疗方案的选择上，了解感染的具体种类对于合理使用抗真菌药物至关重要。因此，CanID-PCR的检测结果不仅有助于临床医生做出更精准的治疗决策，还能为实验室的检测流程提供重要的参考信息。

CanID-PCR的另一个重要优势在于其操作流程的简便性。虽然该方法需要一定的实验操作步骤，但这些步骤主要基于标准的分子生物学技术，易于学习和掌握。此外，研究人员还开发了一种替代方案，使用商业化的DNA提取试剂盒进行宿主DNA去除和微生物DNA富集，这种方法不仅提高了检测的效率，还减少了人为操作的时间和复杂性。通过这种方式，实验室能够在更短的时间内完成检测，同时保持较高的准确性。

在研究过程中，研究人员还发现了一些值得注意的现象。例如，在一个混合感染样本中，CanID-PCR检测到了C. fabianii这一物种，而临床实验室未能识别。这一结果表明，CanID-PCR在某些情况下能够发现传统方法可能遗漏的病原体，为临床诊断提供了新的视角。此外，在另一个样本中，CanID-PCR未能检测到C. tropicalis，而临床实验室报告了该物种的存在。这可能是因为C. tropicalis在厌氧条件下生长受限，导致无法从培养瓶中分离出来。这些发现提示研究人员在解读检测结果时，需要综合考虑样本的培养条件和可能的生长限制因素。

CanID-PCR的广泛应用前景在于其能够在不依赖昂贵设备的情况下，快速、准确地鉴定念珠菌种类。这对于资源有限的医疗机构、研究实验室以及需要及时诊断的临床场景具有重要意义。尤其是在处理混合感染时，CanID-PCR的优势更加明显，因为它能够检测到多个念珠菌种类，而传统方法可能因只分析部分菌落而遗漏某些物种。这种能力不仅有助于提高诊断的准确性，还能为临床治疗提供更全面的信息，从而优化治疗方案。

此外，CanID-PCR的开发还为未来的研究提供了新的方向。例如，研究人员可以进一步优化该方法，以提高对某些难以区分的念珠菌种类的检测能力。目前，该方法在区分C. parapsilosis和C. metapsilosis方面仍存在一定的局限性，未来的研究可能需要通过改进引物设计或引入其他分子标记来解决这一问题。同时，随着分子生物学技术的不断发展，CanID-PCR的检测流程和准确性还有进一步提升的空间。

总的来说，CanID-PCR作为一种快速、准确且成本低廉的检测方法，为念珠菌血流感染的诊断提供了新的解决方案。它不仅能够提高检测效率，还能在某些情况下发现传统方法可能忽略的混合感染，从而为临床医生和研究人员提供更加全面的信息。尽管该方法仍存在一些局限性，但其在资源有限环境中的应用潜力巨大，值得在更多临床和科研场景中推广和使用。通过不断优化和改进，CanID-PCR有望成为一种更加完善的检测工具，为念珠菌感染的诊断和治疗提供有力支持。