红外矩阵辅助激光解吸电喷雾电离原生质谱技术实现蛋白质-配体生物物理参数的快速测定

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Native mass spectrometry enabled by infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization for rapid measurement of protein-ligand biophysical parameters

本刊推荐：为满足现代药物发现对快速、准确测定非共价蛋白质-配体相互作用生物物理参数的需求，研究人员开展了基于红外矩阵辅助激光解吸电喷雾电离质谱（IR-MALDESI-MS）的原生质谱研究。通过碳酸酐酶II（CAH）与磺胺（SLFA）模型体系，成功测定了平衡解离常数（Kd）和最大结合容量（Bmax），每个浓度点分析时间<13秒，为高通量筛选提供了新技术平台。

　　

在当今药物研发领域，科学家们如同寻找钥匙开锁一般，迫切需要在海量化合物中快速找到能够与疾病靶点蛋白精准结合的候选分子。这一过程的核心在于准确测定蛋白质与配体之间的相互作用强度，特别是平衡解离常数（K_d）和最大结合容量（B_max）这两个关键生物物理参数。传统方法如表面等离子体共振（SPR）、等温滴定量热法（ITC）和核磁共振（NMR）虽然可靠，但往往耗时较长，难以满足现代药物发现对高效率的需求。

随着新兴疾病的不断出现，开发新型药物候选物的需求日益紧迫。在药物发现过程中，先导化合物确定后，快速准确测量化合物与其靶点结合的生物物理参数在优化过程中变得至关重要。研究大量小分子的结合亲和力和结合容量可能非常耗时，这表明需要一种高通量方法，能够在合理时间内提供可靠的生物物理数据。

在这一背景下，质谱技术因其高灵敏度、高特异性和快速分析能力而备受关注。然而，传统的电喷雾电离质谱（ESI-MS）在分析速度上仍有局限。近期，一种新型电离技术——红外矩阵辅助激光解吸电喷雾电离（IR-MALDESI）展现出独特优势，它巧妙结合了电喷雾电离（ESI）和矩阵辅助激光解吸电离（MALDI）的优点，成为一种温和的电离源，能够保持蛋白质的非共价相互作用。

在《Analytical and Bioanalytical Chemistry》期刊上发表的最新研究中，Adeleke A. Adepoju、Reza A. Ghiladi和David C. Muddiman研究团队首次将IR-MALDESI原生质谱技术应用于蛋白质-配体生物物理参数的快速测定。他们以碳酸酐酶II（CAH）与磺胺（SLFA）这一经典的非共价相互作用体系为模型，通过配体滴定方法，成功测定了K_d和B_max值，每个配体浓度点的分析时间不足13秒，显著快于传统方法。

研究人员主要采用了红外矩阵辅助激光解吸电喷雾电离质谱（IR-MALDESI-MS）技术，结合自动化孔板平台实现高通量分析；使用碳酸酐酶II（CAH）与磺胺（SLFA）作为模型系统进行方法验证；通过配体滴定实验设计，固定蛋白质浓度而改变配体浓度；利用非线性回归分析结合数据，采用单位点特异性结合模型计算K_d和B_max。

结果与讨论

CAH与SLFA相互作用的原生质谱分析

研究团队首先对纯化的CAH进行了原生质谱分析，观察到电荷态分布范围为8+至11+。在未加入配体时，质谱图中除天然蛋白质信号外，还检测到部分去折叠的蛋白质信号，这可能与蛋白质自身的内在动力学和边际稳定性有关。

当CAH与不同浓度的SLFA孵育后，质谱图显示出明显变化。随着SLFA浓度增加，CAH-SLFA复合物的离子丰度逐渐增加，同时去折叠区域的信号强度相对降低。这一现象表明SLFA与CAH的锌离子活性位点结合后，可能通过诱导蛋白质构象稳定化机制，使CAH更倾向于保持其天然折叠状态。

配体诱导的电荷态分布变化

在较高SLFA浓度条件下（大于CAH浓度），研究人员观察到一个有趣的现象：蛋白质的电荷态分布发生明显收缩。

当SLFA浓度达到60μM时，可观察的电荷态从四个（+11至+8）减少至三个（+10至+8）；在最高浓度250μM时，电荷态分布进一步收缩至两个主要电荷态（+9和+8）。这种电荷态收缩现象可以通过IR-MALDESI的电离机制解释：在高配体浓度下，天然CAH结构更加稳定，电荷载体（如赖氨酸、精氨酸、组氨酸和N末端）的暴露程度降低，导致可用于质子化的位点减少，从而在电离过程中转移的质子数减少。这一现象反映了配体诱导的稳定化效应，也表明蛋白质-配体复合物在气相中的稳定性增强。

生物物理参数的准确测定

通过系统分析不同SLFA浓度下结合分数与游离配体浓度的关系，研究人员成功测定了CAH-SLFA相互作用的生物物理参数。

非线性回归分析得到的K_d值为4.79μM（95%置信区间为2.56-8.62μM），表明CAH与SLFA之间存在中等强度的非共价相互作用。这一结果与文献中通过LESA-MS（3.2μM±1.68）和SPR（4.42μM±1.39、3.1μM±1.10和5.88μM±0.06）报道的数值高度一致，验证了IR-MALDESI方法的可靠性。

特别值得注意的是，IR-MALDESI完成整个测定过程仅需极短时间，每个配体浓度点的分析时间不足13秒，而传统SPR方法通常需要数十分钟至数小时。这种分析速度的优势在需要快速筛选大量化合物的药物发现初期阶段尤为重要。

测定的B_max值为0.74（95%置信区间为0.68至0.81），低于理论最大值1。研究人员认为这可能由两个因素导致：首先，质谱图中观察到的去折叠蛋白质可能减少了可用结合位点的总数；其次，商业购买的CAH活性为2000W-A单位/毫克，低于最高报道活性3500W-A单位/毫克，较低的活性可能导致可用结合位点的减少。这一解释与Illes-Toth等人的观察一致，他们使用活性未明确的CAH制备物时报道的B_max值为0.63。

结论与展望

本研究成功展示了IR-MALDESI原生质谱技术在快速准确测定非共价蛋白质-配体相互作用生物物理参数方面的强大潜力。通过CAH-SLFA模型系统的验证，研究人员证实该方法能够提供与已有文献一致的可靠K_d和B_max值，同时具备显著的速度优势。

IR-MALDESI技术的温和电离特性能够保持天然蛋白质结构及其非共价复合物，结合其高通量分析能力（每秒22个样品），使其在药物发现的先导化合物优化阶段具有重要应用价值。与常规ESI-MS相比，IR-MALDESI的自动化工作流程兼容性更佳，为大规模化合物筛选提供了理想平台。

尽管本研究聚焦于微摩尔级亲和力的相互作用，但研究人员表示正在优化条件以应用于更强结合剂（纳摩尔级亲和力）的非共价相互作用研究。这一技术的发展将为药物发现领域提供强有力的分析工具，加速新型治疗分子的设计与开发进程。

值得注意的是，虽然基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）和声波喷射质谱（AEMS）等技术也能实现快速采集，但本研究采用的Orbitrap质量分析器基于瞬态检测机制，在采集速度和谱图质量之间取得了良好平衡。优化的质谱参数为高通量筛选和原生IR-MALDESI分析提供了理想条件。

总之，这项研究为快速、准确测定蛋白质-配体相互作用参数提供了新技术平台，将有力推动药物发现进程，特别是在需要快速筛选大量化合物的先导化合物优化阶段。随着技术的进一步发展和优化，IR-MALDESI有望成为生物制药行业标准分析工具的重要组成部分。