人特异性RPGR异构体与Rho/ROCK抑制剂联袂拯救视网膜变性——RPGR功能障碍相关缺陷的新疗法

《Molecular Therapy Nucleic Acids》：A human-specific RPGR isoform and a clinically approved Rho/ROCK inhibitor ameliorate defects associated with RPGR dysfunction

本研究聚焦X连锁视网膜色素变性(XLRP)主要致病基因RPGR，发现其人类特异性异构体RPGRs14/15在维持纤毛结构和肌动蛋白动态平衡中发挥关键作用。研究人员通过CRISPR-Cas9技术构建RPGR特异性突变细胞模型，证实RPGR缺失导致纤毛长度异常、近端区段(PS)比例失调及肌动蛋白应力纤维过度稳定。引人注目的是，特异性表达RPGRs14/15的细胞表型与野生型无异，而临床批准的Rho/ROCK抑制剂利帕舒地(ripasudil)能有效挽救RPGR缺失引起的细胞缺陷，为RPGR相关视网膜变性提供了新的治疗策略。

　　

在遗传性眼病研究领域，X连锁视网膜色素变性(XLRP)因其早发性和严重性备受关注。这种疾病的主要致病基因——RPGR基因的突变，会导致视网膜光感受器细胞进行性死亡，最终导致患者失明。然而，科学界对RPGR基因产生的不同蛋白质异构体的功能了解甚少，特别是人类特异性表达的RPGR^s14/15异构体，其生物学功能几乎是个未解之谜。更棘手的是，目前临床上缺乏针对RPGR相关视网膜变性的有效治疗方法。

原发性纤毛作为细胞表面的天线状结构，在光感受器细胞功能维持中扮演着至关重要的角色。RPGR蛋白定位于纤毛过渡区(TZ)，其功能障碍会导致纤毛结构异常，这与视网膜变性的临床表现密切相关。有趣的是，越来越多的证据表明，肌动蛋白细胞骨架不仅参与细胞形态维持，也深刻影响纤毛的形成和功能。先前的研究发现，RPGR缺失会导致肌动蛋白周转异常，形成过度稳定的肌动蛋白应力纤维，进而影响光感受器外节盘膜的生成过程。

为了攻克RPGR相关缺陷，Muhammad Usman等研究人员在《Molecular Therapy Nucleic Acids》上发表了他们的最新发现。他们系统研究了RPGR不同异构体在纤毛结构和肌动蛋白动力学中的作用，并探索了靶向Rho/ROCK信号通路作为治疗策略的可行性。

研究人员主要运用了CRISPR-Cas9基因组编辑技术构建RPGR特异性突变细胞系，通过免疫荧光染色和显微镜技术分析纤毛特性和肌动蛋白动力学，采用蛋白质印迹法(Western blot)和RT-PCR技术检测RPGR异构体表达，并利用药理学方法评估肌动蛋白调节剂细胞松弛素D(CytoD)和Rho/ROCK抑制剂利帕舒地(ripasudil)的治疗效果。实验使用的hTERT-RPE1细胞系由荷兰格罗宁根大学医学中心提供。

生成RPGR特异性突变的hTERT RPE-1细胞系使用CRISPR-Cas9技术

研究人员应用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，成功构建了四种RPGR突变hTERT-RPE1细胞系。其中RPGR_KO1和RPGR_KO2为完全敲除所有RPGR异构体的细胞系，通过在RPGR基因第2外显子引入移码突变导致提前终止密码子。而Δ14/15_1和Δ14/15_2细胞系则通过靶向内含子13和15，实现了特异性只表达RPGR^s14/15异构体。通过RT-PCR和蛋白质印迹验证，确认了这些细胞系中RPGR转录本和蛋白质的表达模式符合实验设计。

异构体RPGR^s14/15定位于原发性纤毛

通过免疫细胞化学分析，研究人员发现野生型、Mock对照以及两种Δ14/15细胞系中，约85%的纤毛呈现RPGR阳性信号，表明RPGR^s14/15异构体能够正常定位到纤毛结构。而在RPGR完全敲除的细胞系中，纤毛RPGR定位显著减少，仅剩5%-10%的纤毛有微弱信号，可能为非特异性抗体结合所致。

异构体RPGR^s14/15保持纤毛长度和分段

研究人员使用ARL13B和GT335两种纤毛标记物，详细分析了纤毛长度和分段情况。结果显示，RPGR完全敲除细胞表现出纤毛长度显著增加，近端区段(PS)长度异常延长，PS与远端区段(DS)的比例失衡。而仅表达RPGR^s14/15的细胞系，在纤毛长度、PS长度及其比例方面均与野生型对照组无显著差异，表明这一人类特异性异构体足以维持正常的纤毛结构。

异构体RPGR^s14/15以及Rho/ROCK抑制剂利帕舒地保持肌动蛋白周转

通过鬼笔环肽(phalloidin)染色评估F-肌动蛋白状态，研究发现约30%的对照细胞存在过度稳定的肌动蛋白应力纤维，反映正常的肌动蛋白周转。而在RPGR完全敲除细胞中，这一比例显著升高至约70%，表明肌动蛋白周转严重受损。令人惊喜的是，仅表达RPGR^s14/15的细胞表现出与对照组相似的肌动蛋白动力学特征。研究人员进一步测试了两种治疗策略：细胞松弛素D(CytoD)处理虽然能溶解过度稳定的应力纤维，但严重破坏了所有细胞系的肌动蛋白细胞骨架平衡；而利帕舒地处理则能特异性挽救RPGR敲除细胞的肌动蛋白缺陷，且不对正常细胞产生副作用。

Rho/ROCK通路抑制剂利帕舒地挽救与RPGR缺失相关的纤毛缺陷

研究人员进一步评估了肌动蛋白调节对纤毛结构的影响。细胞松弛素D处理虽然影响肌动蛋白聚合，但未能纠正RPGR敲除细胞的纤毛异常，反而在所有细胞系中引起纤毛长度和分段比例失调，表现出明显的副作用。相比之下，利帕舒地处理不仅能恢复RPGR敲除细胞的纤毛膜长度和PS长度，还不对对照组和RPGR^s14/15表达细胞产生不良影响，展现出优异的治疗潜力。

本研究首次系统阐明了人类特异性RPGR异构体RPGR^s14/15在维持纤毛结构和肌动蛋白动力学中的关键作用。这一异构体似乎能够通过调节肌动蛋白动态平衡，稳定纤毛架构，其功能不容忽视。更为重要的是，研究发现临床已批准的Rho/ROCK抑制剂利帕舒地能够有效挽救RPGR缺失引起的细胞缺陷，且无明显细胞副作用，为RPGR相关视网膜变性的治疗提供了直接转化的可能性。

从机制角度看，RPGR可能通过调节gelsolin和cofilin等肌动蛋白调节因子影响细胞骨架动力学。RPGR缺陷与小鼠视网膜中RhoA的上调相关，表明RPGR可能对Rho GTPase信号通路进行上游调控。利帕舒地作为ROCK1和ROCK2激酶的强效抑制剂，可能通过恢复肌动蛋白周转平衡，间接纠正纤毛结构异常。

值得注意的是，利帕舒地作为一种已获批用于青光眼治疗的药物，其安全性已有临床数据支持，这大大加快了其重新用于治疗RPGR相关视网膜变性的进程。虽然目前主要通过滴眼液给药，但考虑到视网膜组织的药物递送挑战，未来可能需要探索眼内注射等给药方式以确保足够的药物浓度。

此外，炎症反应在遗传性视网膜疾病进展中的作用日益受到重视。近期研究表明，Rpgr突变小鼠视网膜中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和核因子-κB(NF-κB)的mRNA水平升高，提示炎症通路激活。利帕舒地已知具有抗炎特性，这种双重作用机制——同时纠正细胞骨架异常和减轻炎症——使其成为治疗RPGR相关视网膜变性的理想候选药物。

总之，这项研究不仅深化了我们对RPGR异构体功能特异性的理解，更重要的是发现了一个具有直接临床转化潜力的治疗策略。针对Rho/ROCK通路的干预可能成为治疗RPGR相关视网膜变性的新突破口，为目前缺乏有效治疗手段的患者带来希望。