黑海西部有毒微藻及其相关毒素的出现：2021年9月PHYCOB科考航次的发现

《Harmful Algae》：Occurrence of toxic microalgae and associated toxins in the western Black Sea: insights from the PHYCOB cruise in September 2021

有害藻华（HABs）是黑海生态系统的重大挑战，本研究通过形态学、分子生物学和化学分析，对2021年9月黑海西部23个采样站点的有害藻类及其毒素进行系统调查。共鉴定出假鱼腥草属、多甲藻属、亚历山大藻属等有毒物种，首次记录到黑海地区的亚历山大藻 fragae。检测到环状pectenotoxins（PTXs）、西海岸藻毒素（YTXs）及goniodomin A（GDA）等毒素，其中YTXs在50-200微米颗粒中浓度最高。通过物种分布模型分析发现，营养盐（磷酸盐）和温度是影响有毒藻类分布的关键环境因子。本研究为黑海有害藻华的监测和生态风险评估提供了重要数据支持。

　　有害藻华（HABs）是全球范围内对人类健康、经济和生态系统构成重大挑战的现象，尤其是在黑海地区。黑海作为一个相对孤立的海洋盆地，仅通过博斯普鲁斯海峡与地中海相连，其独特的水文和生态特征，如高淡水输入、强垂直分层、低盐度以及150-200米以下永久性缺氧环境，使得该地区的生物面临特殊的生理条件，从而导致其生态系统多样性低于其他海洋盆地，且更容易受到人为压力的影响。过去，黑海曾因富营养化问题而遭受严重生态影响，特别是在西北部和西部区域。人为造成的营养物质富集以及由此引发的微藻群落增加，被认为是影响黑海生态环境健康的关键生态问题。

有害藻华及其相关问题在全球范围内被观察到，其种类繁多，部分物种会产生强烈的毒素（即藻毒素）。这些毒素可以直接导致鱼类和其他海洋生物死亡，或者通过食物链积累，最终影响更高营养级的消费者，包括人类。随着气候变化的加剧，人们越来越担心它可能会改变有害藻华的地理分布、频率和严重程度。由于有害藻华在区域尺度上的高度变异性，因此需要在地方层面进行高分辨率的监测，以评估其当前状态并预测未来趋势。监测计划和对微藻，尤其是有害藻华物种的更高意识，是迫切需要的，因为这些计划可以保护人类健康免受中毒和死亡的威胁。

在20世纪初，黑海的有害藻华物种已有记录，此后又有新物种被发现。尽管如此，关于黑海有害微藻的知识仍较为零散且不充分，因此需要进一步的、有针对性的研究来应对全球变化环境中的有害藻华问题。2019年春季，在罗马尼亚和保加利亚水域进行的一次海洋学考察中，报告了多种潜在有毒物种和藻毒素变种的存在。此次考察采用了一种整合的形态学和分子生物学方法，鉴定了20种潜在有毒物种，其中一些在研究区域内广泛分布。在该区域首次记录了PTX-1和PTX-13，以及几种YTX变种。随后，PHYCOB项目被开发，以进一步了解黑海中的有害藻华威胁。作为该项目的一部分，在2021年9月，使用形态学和分子技术对西部黑海（包括保加利亚和罗马尼亚水域）的潜在有毒微藻分布和丰度进行了详细调查。同时，还对不同粒径的浮游生物样品中的藻毒素水平进行了分析。此外，潜在有毒的藻类物种被分离并培养，以进行详细的形态学、系统发育学和毒素学特征分析。此次研究将2019年5月在相同研究区域的数据与当前研究结果进行了对比，以探讨物种分布和相关藻毒素的时空变化模式。两场考察的数据都被用于物种分布模型，以绘制西部黑海中与检测到的藻毒素变种相关的潜在有毒物种的栖息地适宜性。

在研究过程中，使用了多种方法进行样本采集和处理。在西部黑海的23个站点，使用R/V TüB?TAK MARMARA号科考船采集了水样，用于分析浮游生物群落组成和藻毒素（包括aza毒素和karlotoxin的检测）。水样是从特定深度采集的，并通过CTD（电导率-温度-深度）罗塞塔装置中的Niskin瓶收集。此外，每站还进行了两次垂直拖网采样，从30米深度到海面，使用了20微米孔径、40厘米直径的Hydro-Bios拖网，用于浮游生物和藻毒素的分析。采集到的拖网浓缩样品被调整至1升，加入过滤海水后分成几个部分。一部分活体拖网样品，加上Niskin瓶样品（从海面、温跃层和最大叶绿素a深度的三个深度合并后的1升样品，经过轻柔浓缩后使用5微米孔径的聚碳酸酯滤膜），在船上使用倒置显微镜（Axioskop 35，Zeiss）配备HD数码相机（Gryphax Jenoptik，Jena，德国）进行微浮游生物群落组成和潜在有毒物种的观察和记录。部分样品被保存以供显微镜分析（20毫升和50毫升，用甲醛溶液缓冲至pH 8.0-8.2，最终浓度为2%）。对于DNA测序分析，从拖网浓缩样品中取出了150毫升样品，使用小于0.2巴的轻柔真空过滤通过1微米孔径的聚碳酸酯滤膜（Whatman，美国）。对于藻毒素分析，从拖网浓缩样品中取出了730毫升样品，通过200微米、50微米和20微米的Nitex筛分进行粒径分级。每个筛网残留物均用过滤海水冲洗，并转移到50毫升离心管中，调整至30毫升。每个管中的内容物被分为两个样品，用于脂溶性毒素（包括domoic acid）和水溶性PSTs的分析。在分样之前，确保样品的均质化，并通过摇晃将快速沉降的物质重新悬浮。随后，样品在3,220 x g的离心力下离心15分钟。离心后，将上清液倒出，将剩余的细胞沉淀物用少量过滤海水重新悬浮，并转移到装有陶瓷珠（lysis matrix D，Thermo BIO 101，法国）的冷冻管中。样品再次离心，小心移除上清液，并将细胞沉淀物存放在-20°C直至进一步处理和分析。

为了检测aza毒素和karlotoxin，从筛选后的样品中取出了8到9.5升的水样，这些水样是从海面（3米）、10米深度和温跃层过滤后的水样中合并获得的。过滤后的样品被保存在-20°C直至进一步处理和分析。此外，还通过扫描电子显微镜（SEM，FEI Quanta FEG 200）对固定样品进行了检查，以进行潜在有毒物种的定性鉴定。这些样品的处理方法如Tillmann等人（2017）所述。

DNA测序分析中，从滤膜中提取DNA后，立即使用5%的Chelex缓冲液进行处理，按照Tanabe等人（2016）的方案进行。提取的DNA被保存在-20°C。为了检测真核生物物种，使用了针对18S rRNA基因V7–V9可变区的通用引物（18S-V7F: TGGAGYGATHTGTCTGGTTDATTCCG 和 18S-V9R: TCACCTACGGAWACCTTGTTACG；修改自Tanabe等人（2016）的方案）。配对末端文库的构建和Illumina Miseq 300 PE平台的测序由Macrogen Inc.（韩国首尔）完成。测序后的数据处理、选择和操作分类单元（OTUs）的分类遵循Dzhembekova等人（2017）描述的工作流程，唯一的例外是将长度超过300 bp的序列截断至300 bp。截断后的序列若长度低于250 bp则被过滤掉。序列被聚类为OTUs，相似度阈值设定为≥99.1%。分类通过BLAST对GenBank数据库中的序列进行。对于物种级别的分类，相似度阈值设定为≥99%。作为额外的验证，所有与有毒物种相关的OTUs的代表性序列均在GenBank在线数据库中手动进行BLAST搜索。

DNA序列可在DDBJ序列读取存档中找到，访问号为DRA014629（生物样本SAMD00515617–SAMD00515639）。

在选择有毒微藻物种时，使用了IOC-UNESCO有害微藻的分类参考清单（Lundholm等人，2009）作为一般参考数据库。然而，该数据集被补充了关于Dinophysis hastata的信息，该物种因缺乏针对性研究而未被列入有毒物种清单，但仍在不同地区的监测计划中被监测（Farrell等人，2018；Fernández等人，2019；Salas和Clarke，2019）。此外，Gonyaulax和Sourniaea diacantha（即Gonyaulax verior的公认分类名称）也被考虑，因为它们的分类学尚未解决，且其毒性和潜在毒性仍不够明确（Riccardi等人，2009；Huang等人，2025b）。所有Gonyaulax spinifera型细胞（基于细胞大小和形状）均被归类到Gonyaulax cf. spinifera类别中。尽管在光镜（LM）下，Pseudo-nitzschia和Alexandrium未被鉴定到种级，但它们在属级被包括在有毒物种数据集中，因为这两个属通常包含大量有毒代表。

另一方面，Phalacroma rotundatum被排除在分析之外，因为该物种可能作为藻毒素的载体而非直接来源（González-Gil等人，2011）。

在提取麻痹性贝类毒素（PSTs）和脂溶性毒素（包括domoic acid）时，向细胞沉淀物中添加了500微升0.03 M醋酸（p.a., Merck, 德国达姆施塔特）用于PSTs的提取，以及500微升甲醇（HPLC级，Merck）用于脂溶性毒素和DA的提取。向每个样品中加入了0.9克陶瓷珠（Lysing Matrix D, Thermo BIO 101）。密封并涡旋后，细胞被通过快速摇晃（最大速度6.5 m/s）进行裂解45秒。随后，将匀浆在4°C、16,100 x g的离心力下离心15分钟。提取物被转移到0.45微米孔径的过滤器（Milipore Ultrafree，德国埃施博恩）中，并在10°C下离心。最后，将滤液转移到高效液相色谱（HPLC）样品瓶中（2毫升，Agilent，德国瓦尔多布隆），并用橡胶密封帽密封。如果需要，将提取物转移到锥形HPLC样品瓶中以增加填充水平。样品在-20°C下保存，直至质谱分析。

对于aza毒素（AZAs）和karlotoxins（KmTxs）的提取，滤膜被用500微升甲醇冲洗直至完全褪色。然后将甲醇提取物转移到过滤器中，并通过离心进行过滤。滤液被转移到分析玻璃瓶中，以便进行后续的质谱分析。

在对PSTs的测量中，采用了选择反应监测（SRM）模式，使用配备Z-Spray源的Xevo TQ-XS三重四极质谱仪（Waters，德国埃斯霍本）。色谱分离在配备在线0.2微米过滤器的Acquity UPLC Glycan BEH Amide柱（130 ?，150 mm?×?2.1 mm，1.7 μm，Waters，德国埃斯霍本）上进行，该柱在60°C下恒流分离，前5分钟使用98%的B相洗脱液，随后线性梯度2.5分钟至50% B相，再1.5分钟恒流洗脱。流速为0.4 mL/min，进样量为2 μL。流动相A由水、0.15%甲酸和0.6%氨组成。流动相B由水/乙腈（3:7，体积比）和0.1%甲酸组成。仪器参数见表S2，使用的质量转换见表S3。PSTs的定量通过外部校准进行，使用包含四种浓度水平的标准混合溶液，包括STX、NEO、GTX2/3、GTX1/4、dcSTX、dcNEO、dcGTX2/3、dcGTX1/4、B1（GTX5）、B2（GTX6）、C1/2、C3/4，这些标准来自加拿大国家研究委员会海洋生物研究所的认证参考材料计划（CRMP）。

对于脂溶性毒素的测量，使用了超高效液相色谱（UPLC?）与串联四极质谱（LC-MS/MS）的组合。UPLC系统包括柱温箱、自动进样器和二元泵（AQUITY I UPLC Class，Waters，德国埃斯霍本）。分离在RP-18柱（Purospher?STAR endcapped（2 μm）Hibar?HR 50-2.1 UPLC，Merck）上进行，该柱配备有预柱（0.5 μm，OPTSSOLV?EXP?，Sigma-Aldrich，德国汉堡）。该系统与三重四极质谱仪（Xevo?TQ-XS，Waters）连接。数据使用Masslynx（版本4.2，Waters）进行采集和分析。为了唯一地识别藻毒素，除了在选择反应监测（SRM）模式中定义的质量转换外，还比较了标准中藻毒素的保留时间与样品中的保留时间。定量评估方法使用了特定的质量转换和默认设置，除了平滑功能被关闭。在某些情况下，记录了增强生产光谱。这些光谱用于通过比较记录的特征碎片模式与文献中的模式来识别已知物质。

在不同藻毒素分析中使用的各种洗脱液和梯度在补充信息中描述（表S4–S9）。使用认证标准溶液进行识别和定量。这些标准包括：gymnodimine A（GYM-A）、13-desmethylspirolide C（SPX-1）、okadaic acid（OA）、dinophysistoxin-1和-2（DTX-1，DTX-2）、pectenotoxin 2（PTX-2）、yessotoxin（YTX）、domoic acid（DA）和aza毒素-1（AZA-1）。GYM-A、SPX-1、OA和PTX-2如PST标准一样来自加拿大海洋生物学研究所，而DTX-1、DTX-2、YTX、DA和AZA-1则来自西班牙Lugo的Laboratorio CIFGA S.A.。此外，还使用了来自A. Andersen的goniodomin A（GDA）标准，以及来自A. Place的KmTx-2标准。筛选的藻毒素的质量转换见表S6（各种藻毒素）、表S7（AZA）、表S8（KmTx）和表S9（YTX）。

在统计分析方面，使用了Spearman等级相关分析，以识别网拖样品中物种丰度与藻毒素水平之间的统计学显著相关性，采用双尾p值阈值为0.05。分析和图形表示在R环境中进行，使用了R统计和编程软件（R Core Team，2021），以及包“tidyverse”（Wickham等人，2019）、“patchwork”（Pedersen，2025）、“viridis”（Garnier等人，2024）、“scales”（Wickham等人，2025）、“corrplot”（Wei和Simko，2024）和“Hmisc”（Harrell Jr，2024），这些包可通过CRAN仓库在线获取（http://CRAN.R-project.org/）。

在2019年春季的调查中，使用了MaxEnt（最大熵）物种分布模型（SDMs）来研究Dinophysis物种以及L. polyedra和P. reticulatum的栖息地分布。物种出现数据来自2019年春季调查的网拖样品的光镜分析，以及本研究中的网和瓶样品。这些数据被作为存在记录来使用。环境变量作为模型输入，包括温度、盐度、洋流、溶解氧、pH、叶绿素a、磷酸盐和硝酸盐浓度。由于过程的动态性，两场采样被视为不同的事件，因此为每个事件开发了独立的MaxEnt模型。因此，开发了两个系列的物种分布模型（SDMs），以评估不同季节变化对物种分布的影响。获得的栖息地适宜性地图SDMs与网拖样品中检测到的藻毒素水平进行了对比。

MaxEnt是一种机器学习方法，已被用于有害藻华物种的分布和栖息地适宜性建模，包括在黑海中（Townhill等人，2019；Goncharenko等人，2021；Rodríguez-Gómez等人，2021；Borges等人，2022a, b；Hu等人，2024）。它使用环境预测因子和存在数据来估计栖息地适宜性（Phillips和Dudík，2008；Elith等人，2011；Phillips等人，2017）。通过应用最大熵原理，确定了一个最均匀的概率分布（即最接近最大熵），同时仍受观察到的出现位置的环境特征所约束。这种方法在处理存在数据时特别有效，并且在多种生态背景和样本规模下都表现出色（Phillips和Dudík，2008；Elith等人，2011；Merow等人，2013；Phillips等人，2017）。

物种分布模型通过使用R包“dismo”（Hijmans等人，2023）、“rJava”（Urbanek，2024）、“rmaxent”（Baumgartner和Wilson，2022）、“raster”（Hijmans，2024a）、“terra”（Hijmans，2024b）和“maps”（Becker等人，2023）采用最大熵（MaxEnt）机器学习方法（Phillips和Dudík，2008；Elith等人，2011；Merow等人，2013；Phillips等人，2017）进行。地图使用QGIS软件（GGI Development Team，2025）创建。

MaxEnt模型的输入数据包括用户指定空间范围内的观察到的物种出现位置和环境预测因子的集合，以及修改背景或伪缺失数据的可能性。MaxEnt采样背景位置，将其与出现位置进行对比，并产生一个物种出现概率（或相对环境适宜性）的估计值，范围从0（最不可能）到1（最可能）（Phillips和Dudík，2008；Elith等人，2011；Phillips等人，2017）。

模型的评估使用了依赖阈值和独立阈值的指标，特别是受试者工作特征（ROC）曲线下的面积（AUC）（Bradley，1997），该指标代表了模型在所有阈值和预测强度下的整体性能，以及真实技能统计（TSS）以评估模型的可靠性（预测与已知出现之间的协议，跨不同二元阈值）（Pearce和Ferrier，2000；Allouche等人，2006；Liu等人，2009, 2011）。TSS被引入为一个受流行度影响较小的指标（Liu等人，2009）：TSS = (TP / (TP + FN)) + (TN / (TN + FP)) - 1，其中TP是真正实例数，TN是真负实例数，FP是假正实例数，FN是假负实例数。用于计算TSS的阈值是最大化真正率TPR = (TP / (TP + FN))和真正率TRN = (TN / (TN + FP))的总和，每个模型中认为最优，确保了对出现和缺失的预测错误同样重要。k折交叉验证用于评估模型性能，k值设为最大5。k值的选择基于从3到5的敏感性分析，考虑了出现记录（存在仅）和研究区域的空间范围。

研究结果显示，多种潜在有毒的微藻物种和藻毒素在2021年9月的保加利亚和罗马尼亚黑海水域被发现。在两个研究区域中，多个潜在有毒的物种和藻毒素被检测到，包括PTX-2、GTX-2/3、GDA、PTX-2sa、PTX-11、PTX-12、YTXs（包括YTX、41-a-homo-YTX、carboxy-YTX、e# 21/22、undesc.、#21、#22等）以及PSTs和GDA。另一方面，aza毒素（AZAs）、karlotoxins（KmTxs）、domoic acid（DA）、环状内酯（gymnodimines和spirolides）、okadaic acid（OA）和dinophysistoxins未在野外样品中检测到。相关的检测限值在补充材料（表S13）中提供。

在2021年9月的调查中，PTX-2和PTX-2 seco酸被检测到，并且与多个潜在有毒物种的细胞丰度存在显著相关性。YTX的变种在网拖样品中与某些物种的细胞丰度表现出中度相关性。此外，与YTX相关的毒素在不同季节和不同样品中表现出不同的水平。尽管某些毒素如PSTs和GDA在样本中被检测到，但它们的水平通常低于欧盟监管限值。同时，GTX-2/3和GDA的检测水平与之前在黑海中的报告有所不同。在本研究中，GTX-2/3在13个站点中被检测到，其水平在20-50微米粒径分数中从0.23到1.8 ng NT?1不等，其中最高值在站点8中记录。GDA仅在三个站点（站点7、13和23）中被检测到，其水平分别为1.9、1.7和2.9 ng NT?1。PTX-2在所有站点中被观察到，其最高水平在站点7的20-50微米粒径分数中达到155 ng NT?1。此外，PTX-2 seco酸在所有粒径分数中被检测到，其水平最高为11.8 ng NT?1，分别在站点7的20-50微米粒径分数中和站点10的50-200微米粒径分数中。YTX的变种在不同季节和不同粒径分数中表现出不同的丰度，其中YTX在22个站点中被检测到，其水平最高为319.7 ng NT?1，出现在站点23的20-50微米粒径分数中。其他YTX变种在不同站点和较低水平中被检测到。所有YTX化合物仅在20-50微米粒径分数中被发现，其水平在深水站点（站点1、4、5和23）中高于沿航线的沿海站点。

研究还探讨了检测到的产毒物种与藻毒素之间的关系。在站点间，潜在有毒的甲藻和其相关毒素共存。Spearman等级相关分析显示，部分数据集中的潜在毒素生产者与相关藻毒素水平之间存在显著相关性。PTXs与D. acuminata和D. sacculus的细胞丰度显示出正相关。PTX-2和PTX-2sa水平与D. sacculus的细胞丰度在两个粒径分数中均表现出强相关性，而在较小的粒径分数（20-50微米）中与D. acuminata表现出中度相关性。对于YTXs，41-a-homo-YTX变种的水平与L. polyedra和Gonyaulax cf. spinifera的细胞丰度显示出中度相关性。

物种分布模型的分析表明，所有模型的AUC值在0.8到>0.9之间，TSS值>0.5，这表明模型的预测性能良好到优秀。得出的分布图与采样活动期间收集的数据结合，表明这些物种共存，并且它们的环境生态位适宜性有显著重叠。模型输出进一步强调了在黑海西部沿海和大陆架水域，这些物种可能具有适宜的栖息地。

在2019年春季，硝酸盐是最主要的预测因子，而温度和磷酸盐对出现概率的贡献相对较小。相比之下，在2021年夏季，磷酸盐浓度是主要影响预测物种出现的变量，而洋流和溶解氧的影响则较弱。物种分布图与藻毒素水平叠加，以评估最高预测概率是否与最高检测到的藻毒素水平相匹配。在两个季节中，最高毒素丰度记录在预测概率最高的区域，但由于生态位重叠，确定特定的藻毒素生产者仍然具有挑战性。

研究结果还表明，尽管在两个采样期间记录的毒素种类有重叠，但某些毒素变种因季节不同而变化，新的毒素仅在夏季采样中出现。Pseudo-nitzschia是检测到的最广泛分布的潜在有毒类群，出现在所有站点，与之前的研究所记录的相似。然而，细胞丰度较低，这可能反映了该属在黑海中的季节性动态。DNA测序仅鉴定出一种Pseudo-nitzschia物种（P. calliantha），而之前的研究所记录的三种物种（P. calliantha、P. delicatissima和P. pungens）则通过DNA测序被检测到。尽管Pseudo-nitzschia在两个采样活动中均是网拖样品中最主要的物种，但未检测到domoic acid。这些发现与PHYCOB采样活动期间分离的P. calliantha菌株中未检测到DA的报告相一致。然而，之前的研究报告称在保加利亚沿海水样中检测到了DA（Peteva等人，2018, 2020b），以及从乌克兰黑海分离的P. calliantha菌株中检测到了DA（Besiktepe等人，2008）。此外，地中海中的P. calliantha菌株也被报告为产毒的，无论是野外研究还是实验室条件（Mari?等人，2011；Tankovi?等人，2022）。由于对DA生产的控制因素缺乏共识，以及大多数Pseudo-nitzschia物种中存在毒性和非毒性的菌株（Bates等人，2018；Lelong等人，2012；Trainer等人，2012），这使得对记忆性贝类毒素模式的解释变得复杂。因此，进一步研究以更好地理解黑海中的Pseudo-nitzschia相关毒性是必要的。

在本研究中，Alexandrium spp.被检测到几乎所有的采样站点，尽管丰度较低。结合不同的方法学方法，鉴定了多个Alexandrium物种，包括毒性和非毒性的代表（如A. andersonii、A. fragae、A. pseudogonyaulax和A. ostenfeldii，以及非毒性的A. tamutum、A. insuetum和A. margalefii）。类似的情况在地中海海水中也被报道（Anderson等人，2012a）。此外，DNA测序在2019年5月检测到了A. minutum。A. fragae、A. minutum和A. tamutum之间的高相似性（Branco等人，2020）在使用的测序标记中得到了反映。例如，在该地区，A. minutum和A. tamutum菌株之间的仅有一个碱基对差异，这使得在该标记下进行物种级别的区分变得不可靠，需要进一步支持。然而，A. tamutum在2021年黑海中的存在得到了菌株分析的支持，而A. minutum在之前的考察中的身份仍未得到确认。另一方面，与A. fragae相关的OTU序列与参考序列相比差异大于2%（超过410 bp），没有分子证据表明A. fragae在样品中存在，尽管其通过SEM分析被鉴定。这些发现突显了在黑海和其他生态系统中，结合野外样本和培养菌株进行物种身份和毒性的确认的重要性，特别是对于那些在LM或DNA测序中难以鉴定的物种，如A. pseudogonyaulax和A. hiranoi（具有相同的标记基因序列）或A. minutum和A. tamutum（高度相似的标记基因序列）。

在本研究中，检测到的藻毒素包括PTX-2和YTXs，其中GTX-2/3和GDA也存在。然而，GTX-2/3的检测频率高于GDA。尽管GDA在保加利亚黑海的浮游生物样品中被报告为存在，但其水平显著低于其他咸水区域的水平（Kremp等人，2019）。在本研究中，DNA测序检测到了一个与A. pseudogonyaulax和A. hiranoi具有相同相似度的OTU，而这两个物种均是GDA的生产者（Lassus等人，2016）。菌株分析确认了A. pseudogonyaulax在PHYCOB样品中的存在，并进一步揭示了其产生GDA的能力（Dursun等人，提交中），明确表明该物种是黑海中GDA的来源。相比之下，GTX-2/3的检测频率较低，尽管其在某些菌株中已被报道为毒素（Kalinova等人，2015；Krumova-Valcheva和Kalinova，2017；Peteva等人，2019, 2020b），并且在俄罗斯水域中也存在（Vershinin等人，2006），但这是首次在浮游生物样品中报告这些毒素。GTX-2/3的水平低于其他地区（Fabro等人，2017；D’Agostino等人，2019）的报告，包括咸水区域（Kremp等人，2019）。这很可能是由于Alexandrium的丰度较低，但不同Alexandrium物种之间的毒素细胞配额差异（Branco等人，2020），以及菌株内部毒素生产的变化（Kremp等人，2019），以及环境因素对毒素生产的影响（Lim和Ogata，2005）可能也起着重要作用。GTX-2/3由多个Alexandrium物种产生，包括A. minutum（Lewis等人，2018）和最近描述的A. fragae（Branco等人，2020）。尽管本研究中未发现A. minutum的证据，但SEM分析确认了A. fragae在黑海中的存在，表明其可能在该地区对PSTs的生产做出贡献。这一问题在A.和GTX-2/3在黑海的先前报告中进行了讨论（Dursun等人，提交中）。

在本研究中，记录了Dinophysis属的五个物种：D. acuminata、D. acuta、D. caudata、D. sacculus和D. hastata。除了D. hastata，其他物种也在2019年5月的网拖样品中被报道（Dzhembekova等人，2022）。相比之下，DNA测序仅检测到了两个Dinophysis物种。这突显了测序方法的局限性。例如，常用的18S rDNA标记（V4和V7-V9）在Dinophysis属中的分辨率有限，因此建议进一步验证分子数据（Dzhembekova等人，2022；Gaonkar和Campbell，2023）。在本研究中，D. acuminata和D. acuta通过top BLAST命中方法被鉴定，尽管其与其他Dinophysis物种的序列相似度相对较高。这些物种的存在通过并行的形态学观察得到了确认。

某些Dinophysis物种对环境变化的高适应性（Rial等人，2023）可能有助于该属在黑海浮游生物群落中的持续存在（Türko?lu和Koray，2002；Petrova和Velikova，2003；Terenko，2011）。此外，黑海西部似乎为Dinophysis物种提供了适宜的栖息地，这与检测到的较高毒素水平区域重叠。

在与Dinophysis相关的毒素中，本研究和之前的研究所检测到的只有PTXs。这可能归因于以下原因：（1）某些菌株仅产生PTXs（Reguera等人，2014）；（2）其他毒素（如okadaic acid和dinophysistoxins）被释放到水柱中（Nagai等人，2011）；或者（3）分析灵敏度，因为PTXs可以检测到比OA/DTXs低得多的水平。在保加利亚水域的样品中检测到的PSTs支持了第一个假设，尽管关于Dinophysis毒素在黑海西部的不确定性仍然存在，尤其是在俄罗斯水域中更为多样的毒素组成（Morton等人，2009）。因此，建立当地菌株的培养是澄清黑海及其他生态系统中物种和菌株身份及毒性的关键。这尤其重要，因为某些物种在LM或DNA测序下难以鉴定，例如具有相同（A. pseudogonyaulax和A. hiranoi）或高度相似（A. minutum和A. tamutum）标记基因序列的物种。

在本研究中，检测到的YTXs和它们的潜在生产者（如P. reticulatum、L. polyedra和Gonyaulax spp.）在黑海西部的浮游生物群落中存在。Gonyaulax cf. spinifera和L. polyedra在春季采样中更为常见（Dzhembekova等人，2022），而P. reticulatum则在本研究中持续存在。值得注意的是，由于Pentaplacodinium的描述（Mertens等人，2018, 2023；Luo等人，2020），P. reticulatum和P. hiranoi之间的分类学存在不确定性。然而，在本研究中，结合Dursun等人（提交中）提供的数据，通过分子证据（测序数据和菌株系统发育）和形态学分析（野外样品和培养的SEM观察）确认了P. reticulatum的鉴定。

尽管在野外样本中记录到的YTXs水平较低，且YTXs的口服毒性较低（Tubaro等人，2003），但P. reticulatum和L. polyedra，以及它们相关的藻毒素，应受到密切监测。这尤其重要，因为该地区记录了L. polyedra的大规模藻华（Velikova等人，1999；Moncheva等人，2001；Terenko和Krakhmalnyi，2021），并且黑海中P. reticulatum的毒素细胞配额比L. polyedra更高（Dursun等人，提交中）。此外，L. polyedra的休眠囊广泛分布于黑海沉积物中，可能为藻华的形成提供潜在的接种源（Dzhembekova等人，2024）。此外，模型输出表明，黑海西部的沿海区域为P. reticulatum和L. polyedra提供了适宜的栖息地，与其他形成藻华的物种重叠。

在本研究中，报告了多种Gonyaulax物种。考虑到Gonyaulax分类学的挑战性，以及Gonyaulax spinifera物种复合体中的隐性多样性（Huang等人，2025a, b），此处报告的Gonyaulax cf. spinifera细胞的身份需要进一步检查和澄清，如Dursun等人（提交中）所述。不幸的是，DNA测序数据和菌株数据未能解决物种级别的鉴定问题，因为它们与现有参考序列的相似度较低。在本研究中，未检测到Gonyaulax sp.和Sourniaea diacantha的毒素生产，但需要进一步研究以更好地阐明黑海中Gonyaulax物种及其相关毒素的多样性。

除了其他潜在有毒的甲藻，还观察到了形成藻华的Prorocentrum cordatum。尽管在实验室条件下尚未描述任何有毒的黑海菌株（Moncheva，1991），但该地区记录了频繁的藻华事件（Moncheva等人，2019），并且某些黑海区域预测了大规模的爆发风险（Goncharenko等人，2021）。因此，监测该物种的潜在有害影响至关重要。然而，需要注意的是，由于存在形态上相似的小型Prorocentrum物种，如P. thermophilum