埃及MDRAB新兴克隆ST85与ST158的基因组特征及药物重定位联合疗法体外评估

《Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials》：Genomic insights into ST85 and ST158 belonging to recently emerged global clones of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates from Egypt: in vitro assessment of repurposed drug–antibiotic combinations

本研究针对埃及亚历山大地区临床分离的耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(CRAB)开展深入分析，聚焦于新兴全球克隆GC9(ST85)和GC10(ST158)。研究人员通过全基因组测序(WGS)、系统发育分析和分子表征技术，揭示了菌株的多重耐药(MDR)表型与携带blaOXA-23、blaADC等多种耐药基因的基因型高度一致，并发现RP-T1型质粒是传播OXA-23碳青霉烯酶的关键载体。研究进一步通过棋盘法评估了药物重定位策略，证实N-乙酰半胱氨酸(NAC)与美罗培南或左氧氟沙星联用对部分菌株具有协同抗菌作用，为临床治疗MDRAB感染提供了新的组合方案。该研究为理解中东和北非地区MDRAB的流行克隆传播及耐药机制提供了重要基因组学证据，并对控制医院内感染暴发具有重要指导意义。

　　

在重症监护病房中，一种名为鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)的革兰阴性菌正悄然成为致命的威胁。这种非发酵菌不仅能够耐受干燥环境，还能在医疗器械表面形成生物膜，使其在医院环境中持续存在。近年来，多重耐药鲍曼不动杆菌(MDRAB)感染率急剧上升，尤其是对碳青霉烯类抗生素耐药的菌株(CRAB)，在某些地区的感染率甚至超过70%。世界卫生组织(WHO)已将CRAB列为急需新型治疗方案的重点病原体。

埃及作为中东地区的重要国家，正面临着MDRAB感染的严峻挑战。2004年至2020年间，埃及临床分离的鲍曼不动杆菌中MDRAB比例高达30%-100%，CRAB比例也达到26.6%-100%。更令人担忧的是，除了广泛传播的GC1和GC2克隆外，新兴的全球克隆GC9(序列型ST85)和GC10(序列型ST158)在这一地区的流行率正在上升，这些克隆携带新的耐药基因组合，可能进一步加剧抗生素耐药性问题。

为了解决这一问题，Mona S.El Far等研究人员对埃及亚历山大地区收集的MDRAB菌株进行了系统研究，重点关注属于GC9和GC10克隆的菌株。他们希望通过基因组学方法揭示这些新兴克隆的耐药和毒力特征，并探索药物重定位策略作为应对MDRAB感染的新途径。研究成果发表在《Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials》期刊上。

研究人员主要采用了全基因组测序(WGS)技术对菌株进行基因组特征解析，通过系统发育分析明确菌株的进化关系，利用棋盘法评估抗生素与重定位药物的联合效果，并运用分子实验方法检测碳青霉烯酶活性和毒力表型。

结果

分子分型与毒力因子基因组学调查

研究人员通过基于巴斯德研究所方案的多位点序列分型(MLST)确认，13株临床分离株中有3株属于ST85(GC9)，10株属于ST158(GC10)。胶囊合成基因座(KL)和外核心脂寡糖基因座(OCL)分析显示，ST85菌株呈现KL200/OCL5模式，而ST158菌株则主要呈现KL6/OCL1和KL23/OCL1模式。毒力基因检测发现，ST85菌株缺失pilE(负责黏附)和hemO(负责血红素利用)基因，但所有菌株均携带多种与其他毒力机制相关的基因。

表型毒力特征检测

生物膜形成实验显示，仅1株菌株(AB45-AUFP)能形成强生物膜，4株和8株分别为中度和弱生物膜形成者。蠕动运动试验表明，除AB45-AUFP外，所有菌株均为阳性蠕动者，蠕动区直径介于11-58mm之间。所有菌株均显示中度的磷脂酶活性和强的蛋白酶活性，但AB37-AUFP的磷脂酶产量较低。

耐药表型特征

所有菌株均对多类抗生素显示耐药，包括β-内酰胺类(含碳青霉烯类)、氨基糖苷类、氟喹诺酮类和磺胺类，但对多黏菌素和米诺环素敏感。值得注意的是，在AB19-AUFP、AB20-AUFP和AB21-AUFP菌株中，多西环素和米诺环素的抑菌圈内观察到菌落生长，提示可能存在异质性耐药。Triton Hodge试验(THT)显示所有菌株均产碳青霉烯酶。

耐药基因基因组成分析

全基因组测序分析显示，所有菌株携带多种耐药基因。氨基糖苷类耐药基因尤为丰富，所有菌株均携带ant(3")-IIa和aph(3')-VIa基因，而aph(3')-Ia、armA和aadA1基因为ST158菌株特有。碳青霉烯酶基因bla_OXA-23在所有菌株中均被检出，ST85和ST158菌株分别携带不同的β-内酰胺酶基因变体：ST85携带bla_ADC-80和bla_GES-11，而ST158携带bla_ADC-117、bla_OXAAb(65)和bla_GES-35。

QRDR突变分析

与鲍曼不动杆菌ATCC 19606相比，所有菌株的GyrA均存在S81L突变。此外，还检测到GyrA的E85G(AB21-AUFP和AB23-AUFP)和E151V(AB31-AUFP)突变。ST85特异性突变包括GyrA的E85V，而ST158特异性突变包括GyrA的A363T和G882S。ParC突变方面，ST85菌株存在E88K和G569S，而ST158菌株存在S84L和S467G。

rep类型鉴定

质粒复制子(replicon)类型分析显示存在6种独特的rep类型，属于R3或RP家族。ST158菌株(除AB44-AUFP外)携带RP-T1、R3-T10、R3-T15、R3-T53和R3-T60五种rep变体，而ST85菌株均携带RP-T1，其中AB37-AUFP还携带R3-T4。

系统发育分析

核心基因组系统发育树包含65株鲍曼不动杆菌临床分离株，分为ST85/GC9(40株)和ST158/GC10(25株)两个主要分支。本研究的13株分离株与亚历山大地区的其他分离株形成亚支，与开罗的埃及分离株分开。ST85菌株中，所有亚历山大分离株形成一个独立谱系，而ST158菌株中，亚历山大分离株形成6个不同的谱系。

质粒结构基因组学分析

从长读长测序数据中回收了三个质粒：pAB11-AUFP1、pAB44-AUFP1和pAB37-AUFP1，大小约为80kb，均属于RP-T1 rep类型。这些质粒携带复制蛋白基因(repA)、接合转移和动员蛋白基因(tra和mobF)以及稳定维持基因(parA、parB和毒素-抗毒素系统基因)。重要的是，这些质粒携带一个转座子Tn_aphA6(含有aph(3')-VIa耐药基因，两侧为ISAba125)和Tn2008(ISAba1直接位于bla_OXA-23上游，ATPase△位于下游)。此外，质粒上还存在一个I类整合子，包含sul1、aac(6')-Ib3、dfrA7、qacE△1和bla_GES基因，两侧为439bp的小反向重复转座元件(MITEs)，可能构成一个推定耐药岛。

AbGRI3耐药岛分析

在AB11-AUFP和AB44-AUFP的染色体上检测到一个IS26侧翼的耐药岛(AbGRI3-2)，大小为20,316bp。该岛包含Tn6180(携带mphE、msrE、armA耐药基因和一个I类整合子)和Tn6179(携带aph(3')-Ia基因，两侧为IS26)。该岛还携带一个不完整的复制起始蛋白基因(repAciN)，属于R3-T60 rep类型，但被认为无功能。

重定位药物与抗生素的联合效果

棋盘法评估了环吡酮胺(ciclopirox)或NAC与美罗培南或左氧氟沙星的联合效果。NAC与美罗培南联用对3株菌株(AB12-AUFP、AB31-AUFP和AB37-AUFP)显示协同作用，美罗培南MIC降低4-16倍。NAC与左氧氟沙星联用对1株菌株(AB11-AUFP)显示协同作用。部分协同作用在美罗培南/NAC(6/13)、左氧氟沙星/环吡酮胺(4/13)、左氧氟沙星/NAC(3/13)和美罗培南/环吡酮胺(1/13)组合中观察到。未发现拮抗作用。

讨论与结论

本研究对埃及亚历山大地区收集的属于新兴全球克隆GC9(ST85)和GC10(ST158)的MDRAB菌株进行了深入的耐药和毒力特征分析。研究发现这些克隆在该地区流行且具有地方性，携带多种耐药基因，特别是由RP-T1型质粒传播的bla_OXA-23碳青霉烯酶基因。系统发育分析表明，亚历山大地区的ST85和ST158菌株与中东和北非其他地区的菌株密切相关，但形成独特的亚支，提示可能存在局部进化。

在毒力特征方面，ST85和ST158菌株表现出不同的生物膜形成能力和蠕动运动模式，这可能与它们适应不同感染部位有关。基因组分析揭示了两个克隆在毒力基因库上的差异，例如ST85菌株缺失pilE和hemO基因，这可能影响其黏附和铁获取策略。

耐药机制分析证实了QRDR突变、多种β-内酰胺酶基因(包括bla_OXA-23、bla_ADC变体和bla_GES变体)以及外排泵基因在介导MDR表型中的共同作用。质粒分析突出了RP-T1 rep类型质粒在传播bla_OXA-23和bla_GES基因中的关键作用。此外，在ST158菌株中鉴定出染色体AbGRI3-2耐药岛，这是首次在ST158菌株中报道该耐药岛，表明耐药基因的传播不仅通过质粒，也通过染色体岛进行。

药物重定位策略的体外评估表明，NAC与美罗培南或左氧氟沙星联用对部分MDRAB菌株具有协同或部分协同作用，这为治疗MDRAB感染提供了新的潜在组合方案。NAC可能通过破坏细菌蛋白二硫键或灭活β-内酰胺酶来增强抗生素效果。

本研究的主要局限在于样本量相对较小，仅进行了体外协同试验，且缺乏基因功能的实验验证。未来需要更大规模的研究和体内实验来确认这些发现。

总之，该研究增进了我们对中东和北非地区新兴MDRAB克隆GC9和GC10的耐药和毒力特征的理解。研究结果强调需要持续监测这些克隆的传播，并探索新的治疗策略，如抗生素与重定位药物的联合使用，以应对日益严重的MDRAB感染问题。