综述：神经内分泌肿瘤起源细胞的新概念

《Virchows Archiv》：Novel concepts of cell-of origin in neuroendocrine neoplasms

本综述聚焦神经内分泌肿瘤（NENs）起源细胞研究的前沿进展。文章系统梳理了胃肠胰（GEP）和肺部NENs的最新分子分型与潜在起源细胞证据，指出其起源具有高度异质性（如胰腺NENs可能源于α/β细胞，肺NENs则与不同气道细胞相关），并强调了细胞可塑性（如治疗诱导的转分化）和新型模型（如类器官、单细胞测序）在解析肿瘤发生机制中的关键作用。这些发现为改进NENs的临床诊断与治疗策略提供了新视角。

引言

神经内分泌肿瘤（NENs）是一组在形态学和行为上高度异质的肿瘤。由于疾病罕见、经典肿瘤抑制基因突变缺失以及模型稀缺，我们对这些肿瘤的进展机制和起源细胞的理解仍然有限。起源细胞的鉴定对于改进诊断和疗法选择至关重要，它能揭示特定细胞类型中进展的机制和调控，具有明确的治疗意义。尽管在B细胞淋巴瘤中，起源细胞分类已用于指导治疗，但这种方法在实体瘤，特别是神经内分泌肿瘤（NETs）中尚未应用。然而，近期数据表明，起源细胞可以对具有不同临床特征的胰腺神经内分泌肿瘤（PanNETs）进行分层，提示这种分类在NETs中也可能具有相关性。

分子分析越来越多地用于识别起源细胞并理解其在肿瘤发展和治疗中的作用。单细胞和空间组学技术的进步提供了关于肿瘤细胞组成、进化动力学和克隆关系的高分辨率数据，这有助于识别起源细胞。然而，对肿瘤组织进行分子分析的主要局限在于，这些组织通常是在疾病晚期获得的，无法重现癌症发展的早期步骤。NET起源细胞的最终证据只能来自体外或体内模型，而对肿瘤组织的研究更多的是提供关于起源细胞的假说。

胸腺NEN

分类和分子谱

肺NENs（也称为肺类癌）目前根据增殖活性（以核分裂象计数和坏死情况衡量）分为高分化肺NET，G1和G2，以及低分化NEC，后者进一步分为大细胞和小细胞癌。与GEP-NETs不同，尽管存在证据，NET G3在目前分类中并未被认可。肺NETs和NECs被视为两种不同的疾病，具有不同的病因（NECs与吸烟密切相关，而NETs则不然）和临床行为。治疗策略也各异：NETs通常涉及手术和长期随访，而小细胞肺癌主要采用化疗，大细胞癌在早期阶段采用手术和化疗（可能加放疗），晚期则采用化疗。

肺NECs和NETs也具有不同的基因组驱动因素。肺NECs几乎普遍由TP53和RB1改变驱动，而肺NETs则可能携带多种驱动基因：MEN1、EIF1AX和ARID1A缺失，近期也有报道少数病例存在BRAF突变。复发性染色体改变如3号和11号染色体缺失，5号、7号和8号染色体增益也有报道。有趣的是，基因组改变与具有不同临床特征的分子组（称为类癌A1、A2、B和超类癌）密切相关。

肺NENs的细胞起源

肺NETs

肺NETs被分为不同的分子组，这些组在基因组、转录组和表观遗传谱上差异显著。有趣的是，这些分子组最近被证明起源于肺的不同部位：A1组肿瘤主要起源于外周（远端），而A2组肿瘤主要起源于支气管内（近端）/中央部位。近期的单细胞测序研究揭示了呼吸系统沿近端到远端轴线的细胞组成存在显著差异，近端主要由基底细胞（中位数80%）和神经内分泌细胞（中位数15%）组成，而远端则有高比例的免疫细胞以及更多的克拉拉细胞、肺泡I型（AT1）和II型（AT2）细胞，神经内分泌细胞比例低于1%。A1和A2肿瘤的不同位置可能反映了它们起源细胞的差异以及不同部位环境（如吸烟、空气污染）和生活方式风险因素的影响。

肺NET分子组还显示出可变水平的转录因子和神经内分泌标志物表达，提示其可能起源于不同的神经内分泌或非神经内分泌细胞。

例如，A1组肿瘤表达重要的经典神经内分泌标志物ASCL1，而A2和B组则没有。Ascl1是脊椎动物神经和神经内分泌细胞定向和分化的已知主调控因子，表明A1组肿瘤可能起源于神经内分泌细胞。A2组肿瘤表达转录因子HNF4A，该因子参与GEP细胞的神经内分泌谱系特化。单细胞神经内分泌细胞谱的反卷积进一步支持了A1和A2与神经内分泌细胞状态的接近，显示它们在基因表达谱上最类似于终末分化的神经内分泌细胞。相比之下，B组肿瘤最类似于克拉拉细胞，这是与肺神经内分泌细胞（PNEC）共享共同祖细胞但经历分泌性细胞类型分化的经典气道上皮细胞。超类癌组肿瘤最类似于未分化的下气道祖细胞，后者是PNECs的已知祖细胞。这表明这个侵袭性组的NETs可能起源于与其他NETs不同的、分化程度较低的细胞，或者它们具有相同的起源细胞但经历了去分化过程。甲基化谱进一步支持了不同分子组具有不同起源细胞的观点。

此外，几乎所有患有弥漫性特发性肺神经内分泌细胞增生（DIPNECH）的NET患者都被证明患有A1组肿瘤。这表明DIPNECH可能是A1组肿瘤的前驱病变，并且该组可能具有具有特定表型和改变细胞状态的病变起源细胞。

由于肺NETs和PNECs的体外和体内模型匮乏，对神经内分泌细胞的生物学理解有限，以及分子谱分析研究的近期性，关于肺NETs起源细胞的实验证据仍然缺乏。重要的是，PNECs因其罕见性、缺乏分离方案以及难以长期培养而闻名。然而，新兴的体外模型有望在未来推动此类研究。

总之，文献提示了肺NETs多种可能的起源细胞。需要更多的研究，特别是使用单细胞测序技术分析NETs、正常神经内分泌细胞和病变组织（如DIPNECH），以及旨在体外重现NET形成的实验，来阐明其起源细胞之谜。

肺NECs

肺癌——大细胞神经内分泌癌（LCNEC）和小细胞肺癌（SCLC）——被认为起源于某些呼吸道上皮细胞。确实，来自SCLC基因修饰小鼠模型的实验数据（其中进行了TP53和RB1的共缺失）表明，多种细胞类型可以产生SCLC，包括神经内分泌前体细胞、AT2细胞、基底细胞和支气管肺泡连接细胞。重要的是，不同的起源细胞与各种驱动事件的相互作用可能是不同癌亚型和患者间异质性的根本原因。有观点认为，控制神经内分泌分化的Rb1缺失可能影响上皮细胞（如祖细胞样AT2细胞）向神经内分泌样细胞状态的转变。最近的一项预印本研究结果来自SCLC的基因工程动物模型，显示起源于基底细胞而非神经内分泌细胞的肿瘤重现了人SCLC。这些结果进一步支持了SCLC可能主要起源于基底细胞可能性。

对LCNEC起源细胞的了解要少得多，证据来自肿瘤分子分析而非直接的体内或体外实验数据。鉴于LCNEC和SCLC共享分子特征，特别是基因组驱动因子TP53和RB1（如上所述，它们似乎参与SCLC中神经内分泌细胞状态的获得），推测LCNEC和SCLC具有相似的起源细胞。SCLC和LCNEC之间基因表达程序的相似性进一步支持了这一点，发现了基于表达谱与SCLC聚类的“SCLC样”LCNEC，以及基于表达谱与LCNEC（RB1改变的LCNEC）聚类的“LCNEC样”SCLC。然而，LCNEC内部的转录组差异值得进一步研究，以验证它们是否可能源于不同的起源细胞。确实，虽然LCNEC I型分子组呈现神经内分泌谱，包括高表达ASCL1，但LCNEC II型组呈现神经内分泌标志物表达降低。这究竟是源于具有不同神经内分泌分化水平的起源细胞，还是LCNEC启动后去分化过程的结果，目前尚不清楚。

总体而言，这些结果表明细胞可塑性，特别是在神经内分泌细胞（去）分化方面，可能普遍存在，并且是精确定位不同NEC实体确切起源细胞困难的原因。需要更多的工作，包括使用更真实的实验模型和高分辨率测序技术（特别是针对LCNEC），来解读疾病过程中的细胞状态轨迹。

肺NENs中的转分化

在肺部，癌（腺癌和鳞状细胞癌）在治疗后向SCLC的转分化是最常报告的转分化事件。这尤其发生在EGFR突变的非小细胞肺癌（NSCLC）中，当对抗EGFR治疗产生耐药性时。这表明神经内分泌分化具有可塑性，可以被不同起源的细胞获得，包括可能来源于肺泡细胞的细胞。LCNEC和SCLC之间的转分化也由存在结合的LCNEC和SCLC肿瘤所提示，这些肿瘤大多涉及Rb1缺陷，其中Rb1缺失在LCNEC和SCLC组分之间共享，提示了共同的起源。在NETs和NECs之间，最近一项研究表明，在不吸烟者中，SCLC可能源于低级别NET的转分化，通过染色体碎裂（一种染色体畸变事件，其中多条染色体在一次细胞分裂中破碎并由DNA修复机制重新组装）形成染色体外DNA，其中癌基因CCND1或CCN2/CDK/MDM2被强烈扩增。这与证明存在跨越肺NET和NEC之间屏障的实体的工作一致，例如具有肺NET形态但具有肺NENs（特别是LCNEC）分子和临床特征的超类癌。

GEP-NEN

分类和分子谱

GEP-NENs根据增殖指数分为高分化NETs，G1、G2和G3级，以及低分化神经内分泌癌（NEC），后者具有更强的侵袭性。GEP-NENs的治疗策略取决于其分级和大小。通常包括手术和长效生长抑素类似物、依维莫司、舒尼替尼或NET的化疗，而NECs的一线治疗是铂类化疗。GEP-NET和NEC具有不同的遗传驱动因素。例如，在胰腺中，NETs在MEN1（MENIN）、DAXX（死亡结构域相关蛋白）、ATRX（α地中海贫血X连锁综合征）和编码mTOR通路基因中存在反复突变，而NECs常显示TP53突变和RB1缺失。然而，虽然胰腺NENs的遗传背景已得到较好表征，但其他GEP-NET的遗传驱动因素了解较少且常常未知。在小肠NETs（Si-NETs）中，只有10%的患者携带CDKN1B（p27）基因突变。其他罕见突变见于BCOR、FAT1、MUC5AC和MCAM。PanNETs也呈现反复的拷贝数变异（CNVs）。基于CNVs，PanNETs可分为三组。一组富含具有11、21、10、16、2、22、6、1、8和3号染色体反复缺失的PanNETs，以及MEN1、DAXX和ATRX突变。第二组显示较少的CNVs，除了11号染色体缺失和MEN1杂合性缺失。该组中的PanNETs主要发生MEN1突变。第三组呈现可变非整倍性，具有不同的增益和缺失。

GEP-NEN的细胞起源

低级别PanNENs

低级别PanNENs包括G1和G2级PanNETs。尽管它们的起源细胞尚未完全阐明，但实验证据和肿瘤分子分析都表明它们起源于成年胰腺胰岛细胞，包括5种不同类型的细胞：α-、β-、γ-（或PP）、δ-和ε-细胞，分别产生胰高血糖素、胰岛素、胰多肽、生长抑素和ghrelin，而不是起源于祖细胞或干细胞。

研究肿瘤发展的早期阶段可以让我们深入了解起源细胞。虽然在散发性肿瘤中前驱病变难以诊断，但患有家族性MEN1综合征的患者在胰腺中出现多发性病变，包括微腺瘤（微肿瘤），这可以为肿瘤启动过程提供重要信息。这些微肿瘤的激素表达显示，53%表达胰高血糖素（由α细胞产生），20%表达胰多肽（由γ细胞产生），15%表达胰岛素（由β细胞产生）。这种分布并不代表各自胰岛细胞的丰度，提示α和γ细胞对MEN1突变的易感性增加。有趣的是，最近基于单细胞数据提出了α和γ细胞的共同祖细胞。α细胞对MEN1突变的易感性也通过以下事实得到证实：起源于β细胞的散发性胰岛素瘤很少显示MEN1突变，相反，25%的病例在转录因子YY1中发生突变。非功能性PanNETs（NF-PanNETs）则在近40%的病例中呈现DAXX或ATRX突变，通常与MEN1相关。胰岛素瘤表达PDX1，这是一种参与β细胞分化的转录因子，而大多数NF-PanNETs是ARX阳性，后者调节α细胞分化。这些数据表明NF-PanNETs主要起源于α细胞，而胰岛素瘤起源于β细胞。有趣的是，DAXX/ATRX缺失仅在也表达ARX的恶性转移性胰岛素瘤中观察到，这与正常β细胞分化不一致，反而提示可能存在从α细胞到β细胞的转分化。类似地，在α细胞特异性Men1敲除转基因小鼠中发展的胰高血糖素瘤在疾病晚期转分化为胰岛素瘤。耐人寻味的是，无论在胰腺内分泌和外分泌的祖细胞（Pdx1）、β细胞还是α细胞中发生敲除，转基因Men1敲除小鼠主要发展胰岛素瘤，支持了多细胞起源的假说。这些数据强调了Menin在小鼠和人类中可能存在的功能差异。

表观遗传谱在细胞分化过程中形成，可用于识别不同组织或癌症类型的起源细胞。最近，H3K27ac超级增强子谱识别出PanNETs的两个主要亚型。这包括表达ARX的α样肿瘤和表达PDX1的β样肿瘤。少数PanNETs显示两种转录因子均表达或均不表达。类似地，DNA甲基化将PanNETs分为三组：表观遗传上类似于β细胞的β样肿瘤，表观遗传上接近α细胞的α样肿瘤，以及逐渐丧失特定细胞分化但仍保持α样特征的中间型肿瘤。

β样PanNETs主要是胰岛素瘤，显然起源于β细胞，具有独特的β细胞转录因子表达。α样和中间型肿瘤表达ARX，表明它们可能起源于α细胞。α样肿瘤富含MEN1突变，拷贝数变异低，通常体积小，预后良好；而中间型肿瘤富含MEN1和DAXX/ATRX突变（ADM），拷贝数变异高，体积大，复发风险高。这些数据提示在获得DAXX/ATRX突变后，α样肿瘤进展为中间型ADM。中间型肿瘤偶尔表达干细胞标志物，然而，干细胞起源仍未得到证实。转录组分析揭示了一组具有侵袭性表型和祖细胞样特征的PanNET，即转移样原发性肿瘤（MLP1），以及β细胞分化的进行性丧失。

高级别PanNENs

高级别PanNENs包括高分化G3 PanNETs和低分化胰腺神经内分泌癌（PanNECs）。高分化G3 PanNETs表现出与低级别PanNETs相似的基因组驱动因素，包括MEN1、DAXX、ATRX、PTEN、TSC2，以及特定的驱动因素如TP53。PanNECs则呈现与胰腺导管腺癌相似的突变，如TP53、KRAS、BRAF、PIK3CA/PTEN，提示其可能具有与PanNET不同的起源细胞，随后向神经内分泌表型转分化。DNA甲基化谱能有效区分PanNECs和G3 PanNETs。确实，虽然G3 PanNET在表观遗传上类似于α细胞，但PanNECs更接近腺泡细胞，暗示了可能不同的起源细胞。一致地，PanNEC显示SOX9阳性，并丢失内分泌转录因子ARX和PDX1的表达。SOX9在胰腺发育过程中具有重要作用。在分化过程中，SOX9在多能祖细胞中表达，而在成年胰腺中，只有导管和中心腺泡细胞维持其表达。一部分PanNETs也表达SOX9，表明NET在进展过程中也可能失去内分泌分化，同时获得祖细胞样特征。最近基于突变和表观遗传谱提出，PanNECs由两个不同的组组成：起源于腺泡细胞的那些和起源于导管细胞的那些。导管PanNECs表达导管谱系标志物，如SPP1和CFTR，它们携带KRAS和TP53突变以及RB缺失。转录因子SOX2和ASCL1的表达以及相应基因位点染色质可及性增加也是这些亚型的特征。SOX2在胚胎干细胞和神经元祖细胞中表达，并显示在前列腺癌中促进谱系可塑性。腺泡PanNECs以CDKN2A改变和WNT信号通路改变为特征。腺泡和导管PanNECs是起源于两种不同的细胞类型，还是起源于同一种细胞然后遵循不同的转分化路径，需要进一步的研究和适当的模型。最近的研究结果证明了五个不同的G3 NETs（三个PanNETs，一个垂体肿瘤和一个原发部位不明的肿瘤）通过获得TP53和RB1突变向NEC表型进展。值得注意的是，在这项研究中，所有高级别NENs都保留了与它们起源的低级别NETs相同的NET相关基因（如DAXX、ATRX和MEN1）突变。这些数据表明，获得NECs典型的突变可以驱动低级别肿瘤向更具侵袭性的高级别表型发展，并提示NETs和NECs可能存在共享的起源细胞。在小鼠中，通过β细胞特异性表达SV40大T抗原来损害肿瘤抑制蛋白p53和pRb的功能，导致具有NEC特征的恶性胰岛素瘤的发展。重要的是，来自这种RIP1-Tag2小鼠模型的PanNENs的转录组特征揭示了两种不同的亚型：胰岛肿瘤（IT）和转移样原发性（MLP）。虽然IT包括具有低转移潜能的胰岛素瘤，但MLP具有高度侵袭性，其转录组程序类似于肝转移。此外，Saghafinia等人证明IT肿瘤可以通过去分化过程进展为MLP肿瘤。

肠道NETs

小肠肿瘤被认为起源于肠道的肠内分泌细胞。最近一项关于Si-NET的多组学研究揭示了4种不同的亚型：上皮型、囊泡型、免疫型和间充质型。比较肠道正常细胞的批量RNA转录组谱，作者显示具有上皮特征的肿瘤富含肠细胞/杯状细胞前体标志物，囊泡型肿瘤与肠嗜铬细胞特征相关，间充质型与祖细胞和干细胞样谱相关。有趣的是，间充质型的特征是胰高血糖素原表达完全缺失，表明神经内分泌分化的丧失。这些发现提示Si-NETs可以起源于不同的肠内分泌分化模式。直肠NETs分为L细胞（产生PP/PYY）肿瘤（表达神经内分泌标志物）和肠嗜铬细胞（产生血清素）肿瘤（表达与Si-NETs相似的标志物，如嗜铬粒蛋白A），因此推测具有不同的起源细胞。

GEP-NENs中的转分化

在PanNEC中，观察到外分泌谱系标志物（如胰蛋白酶、MUC1和CEA）的表达并不罕见，这强调了细胞可塑性和可能的转分化。在胰腺导管腺癌的小鼠模型中，显示神经内分泌癌细胞的转分化是MYC依赖性的。类似地，前列腺癌可以演变成侵袭性亚型，获得神经内分泌分化，通常也是在治疗后，也通过C-MYC。少数情况下，肿瘤呈现混合细胞群，包括神经内分泌和非神经内分泌细胞（MiNENs），其中两种成分至少占肿瘤质量的30%。胃肠道MiNENs的分子分析显示，两种成分共享一组核心突变，同时也呈现私有突变，提示存在共同的起源细胞，该细胞在进展过程中因额外的遗传改变而分化为两个不同的实体。共享的突变通常包括TP53、APC、KRAS和BRAF，并且等位基因频率高于私有突变，提示早期发生。有趣的是，通常神经内分泌成分携带更高的等位基因不平衡，提示更具侵袭性的生物学特性。有观点认为，通常是非神经内分泌部分转分化为神经内分泌部分，这一过程似乎由c-MYC介导。然而，在胃神经内分泌癌的小鼠模型中，显示在突触素阳性的胃内分泌细胞中删除MYC会诱导产生混合肿瘤，包含内分泌和外分泌成分，提示转分化和两种实体的共同细胞前体。总之，神经内分泌表型似乎是在具有不同起源细胞的肿瘤进展过程中获得的。

未来方向

新型实验模型

肿瘤来源的类器官是研究癌症发生、进展和治疗的有前景的模型。尽管由于生长缓慢和难以在体外维持其生长的培养条件而长期难以获得，但用于NENs，特别是NETs的类器官模型最近已经建立。确实，Kawasaki等人开发了一个包含25个患者来源类器官系的生物库，这些类器官来自GEP-NETs和GEP-NECs。这些类器官可靠地复制了原始肿瘤的组织学和功能特征，包括它们对激素疗法（如生长抑素类似物）的反应。重要的是，虽然从NECs成功建立了22个类器官系，但只有3个NET系能够长期稳定维持，这突显了在体外培养缓慢增殖的NETs所面临的持续挑战。然而，这一集体努力标志着在解决GEP-NEN模型稀缺问题（主要源于疾病罕见性）方面迈出了重要一步。正常组织的类器官有助于剖析肿瘤的起源细胞。有趣的是，在正常结肠类器官中敲除TP53和RB1并不会上调神经内分泌标志物的表达。进一步过表达转录因子ASCL1、NEUROD1、POU3F2、NKX2-5和TP73，可以使该模型发生神经内分泌分化并获得NEC特征。

培养肺NENs的关键成分是在培养基中添加表皮生长因子（EGF）。然而，在肺NETs中，这种培养基只允许A1组的肿瘤生长，提示NET细胞可能依赖于其微环境提供的不同生长因子，因此除了起源细胞之外，特定的起源肿瘤微环境对于致癌作用也是必要的。与这一假设一致，转录组分析提示不同肺NET分子组具有非常不同的肿瘤微环境。在稀有的可用细胞系中，肺NEC最为丰富。然而，细胞系固有的缺乏异质性阻碍了它们用于研究生物学和治疗。

总之，近年来出现了实验模型，将使我们能够研究NENs的起源细胞，但需要更多的工作来获得完美的模型。需要进一步的体外和体内模型来清楚地阐明NENs中的起源细胞。具体来说，在不同细胞类型（神经内分泌和非神经内分泌）中进行正向遗传学等方法可能有助于剖析起源细胞。肿瘤微环境也可能在肿瘤启动中起关键作用，因此需要考虑这方面的体内和体外模型。获得健康器官的真实模型，特别是在不同发育状态和重现器官不同部位（例如近端或远端气道）以及罕见细胞类型（例如神经内分泌细胞及其祖细胞）的模型，对于验证关于不同NENs起源的假说至关重要。

新技术

高分辨率测序技术——包括单细胞和空间转录组学及蛋白质组学——正在揭示正常和肿瘤组织的异质性，并彻底改变我们对器官和癌症发展的理解。特别是，单细胞分辨率的空间测序有可能揭示影响正常细胞向癌细胞转化的关键细胞相互作用，可能阐明微环境的作用以及潜在风险因素（如吸烟和空气污染）的作用方式，以及细胞分化轨迹。尽管大多数器官的常见癌症，如肺（腺癌）和胰腺（导管腺癌）已经受益于单细胞革命，但大多数NENs，特别是NETs，尚未在此高分辨率下进行测序。生成泛癌NEN图谱将是推进NENs起源细胞研究的关键。另一项可能改变游戏规则的技术是应用于计算病理学的深度学习。视觉编码器允许将全玻片图像（WSI）的切片转换为简单的数值向量，这些向量捕获了组织中细胞和组织本身的基本形态特征。尽管早期的监督模型需要在给定肿瘤类型的大量WSI上进行广泛训练，但新一代在数亿张诊断图像上训练的自监督基础模型近年来已经出现。这些模型允许进行零样本学习，无需大量目标肿瘤类型的图像数据库，也无需超级计算机，非常适合罕见肿瘤研究的需求，如NENs研究。重要的是，与单细胞和空间转录组学等成本高昂的技术（由于其高昂成本，研究仅限于少数样本）不同，深度学习模型一旦训练完成，可以轻松用于大量玻片。这些模型已经在量化组织内的细胞类型、识别罕见细胞群、识别具有特定基因组改变的细胞方面显示出良好的准确性，因此可以帮助完成寻找NENs起源细胞过程中的许多关键任务，例如帮助识别难以捉摸的前驱病变、识别指示细胞分化轨迹的形态学梯度，或识别促肿瘤微环境生态位。

结论

总之，神经内分泌肿瘤的起源细胞仍有待阐明。尽管从分子研究中涌现出有前景的新假说，但缺乏使用真实模型（如类器官）的实验验证，并且对当前和新兴技术进步的利用不足。阐明起源细胞可以为肿瘤形成的驱动因素提供重要见解，从而改进治疗。我们鼓励在这个方向上进行进一步的研究，以揭示能够赋能这些疾病临床管理的基础信息，为预防、癌症拦截策略以及未来治疗的所有阶段提供信息。