免疫代谢前药新策略：靶向DHODH-STING轴克服难治性黑色素瘤耐药性

《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》：An immunometabolic prodrug strategy overcomes DHODH inhibitor resistance in refractory melanoma

本研究针对DHODH抑制剂在STING低表达黑色素瘤中的耐药难题，开发了肿瘤选择性前药H62。该药物通过CTSB可切割 linker 同步释放DHODH抑制剂EA6与STING激动剂MSA-2，成功诱导线粒体焦亡并激活NK细胞免疫应答，在多种黑色素瘤模型中显著抑制肿瘤生长并降低术后复发率，为免疫代谢联合治疗提供了创新策略。

　　

黑色素瘤作为最具侵袭性的皮肤恶性肿瘤，其治疗耐药性一直是临床面临的严峻挑战。近年来，代谢重编程被确认为癌症的重要标志之一，其中嘧啶核苷酸的从头合成通路异常活跃，不仅为肿瘤细胞的快速增殖提供原料，还通过塑造免疫抑制微环境帮助肿瘤实现免疫逃逸。二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)作为该通路中唯一的线粒体酶，已成为极具潜力的治疗靶点。然而，研究人员发现，在难治性黑色素瘤中，DHODH抑制剂的疗效受到严重限制，这种耐药性与细胞内源性干扰素基因刺激因子(STING)表达水平低下密切相关。

为突破这一瓶颈，Hai等人创新性地设计了一种肿瘤选择性前药H62，该分子通过组织蛋白酶B(CTSB)可切割的连接子，将高效DHODH抑制剂EA6与STING激动剂MSA-2共价连接。这一精巧设计使H62能够在蛋白酶富集的肿瘤微环境中特异性激活，同步发挥代谢干预与免疫激活的双重功能。

研究团队采用了一系列关键技术方法验证H62的疗效与机制：通过高效液相色谱(HPLC)分析前药降解动力学；利用Western blot检测关键蛋白表达与磷酸化水平；采用流式细胞术评估免疫细胞亚群与活化状态；通过ELISA测定细胞因子分泌；建立小鼠黑色素瘤模型进行体内疗效评价；并利用临床样本进行免疫组化分析。所有人体组织样本均获自复旦大学附属肿瘤医院患者并经伦理委员会批准。

STING表达调控黑色素瘤对DHODH抑制的敏感性

研究人员发现，黑色素瘤细胞系对DHODH抑制剂的敏感性存在显著差异。B16F10细胞表现出明显耐药性，而A375细胞则相对敏感。机制研究表明，B16F10细胞中STING蛋白表达水平显著低于A375细胞。通过shRNA敲低B16F10细胞中的STING表达，研究人员发现这不仅上调了DHODH的表达，还减弱了EA6诱导的细胞毒性，证实低STING表达是导致DHODH抑制剂耐药的关键因素。临床样本分析进一步显示，黑色素瘤组织中DHODH表达升高而STING表达降低，且DHODH抑制与NK细胞浸润呈正相关。

前药H62的体外抗肿瘤活性

研究人员首先评估了EA6与MSA-2的联合用药效果，发现1:1摩尔比时协同作用最佳。基于此，他们合成了CTSB激活的前药H62，结构表征通过1H-NMR、13C-NMR和高分辨质谱(HRMS)确认。降解动力学实验表明H62在CTSB存在下6小时内近乎完全释放活性成分。体外实验显示，H62能有效诱导黑色素瘤细胞死亡，抑制长期增殖，并引发典型的焦亡形态学改变。尤为重要的是，H62在增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力的同时，对NK细胞本身无明显毒性，体现了良好的肿瘤选择性。

H62通过抑制DHODH诱导焦亡并招募NK细胞放大肿瘤细胞焦亡

机制研究表明，H62处理显著增加了细胞内活性氧(ROS)水平，诱导线粒体膜电位去极化。Western blot分析显示H62促进了caspase-3的激活和GSDME的切割，同时增加了乳酸脱氢酶(LDH)和三磷酸腺苷(ATP)的释放，以及炎症因子IL-1β和趋化因子CCL5的分泌。通过siRNA敲低DHODH表达或外源添加尿苷，均可逆转H62的细胞毒性，证实其作用依赖于DHODH抑制。Transwell实验表明H62预处理可显著增强NK细胞向肿瘤细胞的迁移，共培养实验进一步显示H62增强了NK细胞介导的肿瘤细胞杀伤。

H62激活STING通路并增强NK细胞活化

Western blot分析显示，H62处理显著增加了STING、TANK结合激酶1(TBK1)和干扰素调节因子3(IRF3)的磷酸化水平。共聚焦显微镜观察发现H62增强了NK细胞与肿瘤细胞间免疫突触的形成。ELISA检测表明H62促进了IFN-β的分泌，流式细胞术分析显示H62处理增加了NK细胞中颗粒酶B、穿孔素和活化标志CD69的表达。STING敲低实验证实STING信号通路是H62发挥抗肿瘤作用所必需的。

H62在体内表现出强大的抗肿瘤活性

在B16F10黑色素瘤小鼠模型中，H62治疗显著抑制了肿瘤生长，且未引起明显体重变化或系统毒性。肿瘤组织分析显示H62处理组中CCL5、IFN-β和IFN-γ水平显著升高，H&E染色显示广泛的核碎裂和细胞溶解，Ki-67染色显示增殖活性降低。免疫组化和免疫荧光染色证实H62同时抑制了DHODH表达并激活了STING通路。生存分析显示H62治疗显著延长了小鼠生存期。

H62诱导强大的抗肿瘤免疫应答

流式细胞术分析显示，H62治疗改变了NK细胞在脾脏、肿瘤引流淋巴结和肿瘤组织中的分布与活化状态。虽然脾脏和引流淋巴结中NK细胞比例有所下降，但活化NK细胞(CD69+)比例显著增加，表明H62促进了NK细胞的活化与迁移。

H62的抗肿瘤作用依赖于DHODH抑制和STING介导的NK细胞活化

体内机制验证实验表明，外源尿苷补充可逆转H62的抗肿瘤效果，证实DHODH抑制的关键作用。STING敲低显著削弱了H62的疗效，并降低了血清IFN-β水平。NK细胞清除实验进一步证明，NK细胞是H62发挥抗肿瘤作用所必需的效应细胞。

H62增强新辅助治疗和免疫检查点阻断疗效

在新辅助治疗模型中，H62术前治疗显著减缓了肿瘤生长，降低了术后复发率，延长了生存期。此外，H62与抗PD-1抗体联合使用产生了协同抗肿瘤效果。生物信息学分析显示，DHODH低表达与较低的肿瘤免疫功能障碍和排斥(TIDE)评分相关，而STING激活则提高了TIDE评分，提示DHODH抑制与STING激活联合可能增强免疫检查点抑制剂的疗效。

本研究通过巧妙的分子设计成功克服了黑色素瘤对DHODH抑制剂的耐药难题。H62前药策略实现了肿瘤微环境特异性的药物释放，同步靶向嘧啶代谢与先天免疫通路，诱导肿瘤细胞焦亡并激活NK细胞介导的免疫应答。在多种黑色素瘤模型中，H62表现出显著的抗肿瘤活性，能够抑制肿瘤生长、减少术后复发、延长生存期，并与免疫检查点阻断剂产生协同效应。这一研究不仅为克服黑色素瘤治疗耐药提供了创新策略，也为其他免疫治疗抵抗性恶性肿瘤的联合治疗开辟了新方向。未来研究可进一步探索H62在其他肿瘤类型中的适用性，以及其与不同免疫治疗方案的组合潜力，推动这一创新策略向临床转化。