MPTP介导的Ox-mtDNA释放可诱导巨噬细胞发生焦亡，并通过促进ITPR3/Ca2+/NLRP3通路加剧MCD引起的MASH症状

《Journal of Translational Medicine》：MPTP mediated Ox-mtDNA release inducing macrophage pyroptosis and exacerbating MCD-induced MASH via promoting the ITPR3/Ca2+/NLRP3 pathway

氧化mtDNA通过ITPR3/Ca2+/NLRP3轴促进代谢相关性脂肪性肝炎（MASH）进展，抑制mtDNA释放可缓解巨噬细胞焦亡和肝损伤。

　　### 非酒精性脂肪性肝炎（MASH）与氧化线粒体DNA（Ox-mtDNA）释放机制的深入研究

非酒精性脂肪性肝炎（Metabolic Dysfunction-Associated Steatohepatitis, MASH）是代谢异常相关脂肪性肝病（Metabolic Dysfunction-Associated Steatotic Liver Disease, MASLD）的一种严重且进展性形式，其全球患病率已达到约25%的成年人口，其中20%-30%的MASLD患者可能发展为MASH。随着全球代谢性疾病和肥胖的增加，MASH的发病率持续上升，对人类健康构成了严峻挑战。MASH不仅会导致肝纤维化和肝硬化，还可能进一步发展为肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC），成为肝移植的主要适应症之一。因此，深入探索MASH的发病机制，特别是与免疫炎症反应相关的关键分子，对于开发新的治疗策略具有重要意义。

肝固有免疫系统在MASH的发病过程中发挥着核心作用，其中肝巨噬细胞是主要的效应细胞之一。肝巨噬细胞能够通过识别病原体相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs），以及代谢产物（如游离脂肪酸，Free Fatty Acids, FFA）等，启动炎症反应并释放趋化因子以招募和激活其他免疫细胞。这种免疫炎症反应不仅促进了局部炎症的发展，还与肝纤维化和组织损伤密切相关。因此，研究肝巨噬细胞在MASH中的作用机制，特别是其与炎症反应和细胞死亡过程之间的联系，成为当前研究的重点。

在MASH的发展过程中，细胞焦亡（pyroptosis）被认为是一个关键的病理事件。细胞焦亡是一种程序性细胞死亡形式，主要由NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3（NLRP3）炎性小体和Gasdermin D（GSDMD）信号通路介导。NLRP3炎性小体通过激活Caspase1，将GSDMD切割为GSDMD-N，后者形成膜孔并导致细胞内容物的释放，从而引发强烈的炎症反应。然而，目前对于MASH中导致巨噬细胞焦亡的具体分子机制仍不完全清楚，尤其是Ox-mtDNA是否通过特定的信号通路调控焦亡的发生。

Ox-mtDNA是一种在细胞质中形成的氧化损伤产物，它通过激活NLRP3炎性小体，引发炎症级联反应。近年来的研究表明，Ox-mtDNA在多种病理过程中扮演重要角色，包括代谢性疾病、自身免疫性疾病和神经退行性疾病等。特别是在MASH中，Ox-mtDNA被认为可能通过调控巨噬细胞焦亡，进一步加剧肝损伤和疾病进展。然而，其具体分子机制尚未完全阐明，尤其是在Ox-mtDNA如何与钙离子（Ca2?）和NLRP3炎性小体之间的相互作用方面。

本研究通过建立MASH的动物模型和体外巨噬细胞模型，探讨了Ox-mtDNA在调控巨噬细胞焦亡中的作用。首先，通过使用甲硫氨酸和胆碱缺乏饮食（MCD）诱导MASH模型，研究发现Ox-mtDNA的释放显著增加，同时巨噬细胞焦亡的特征也明显增强，如Caspase1和GSDMD-N的表达上调、细胞膜破裂、线粒体肿胀以及促炎因子（如IL-1β和IL-18）的释放。这些结果表明，Ox-mtDNA在MASH中可能通过激活焦亡途径，加剧肝损伤。

进一步的研究发现，使用环孢素A（CsA）阻断线粒体渗透性转换孔（mPTP）的开放可以有效减少Ox-mtDNA的释放，从而减轻巨噬细胞焦亡和肝损伤。这表明，Ox-mtDNA的释放是巨噬细胞焦亡的重要诱因。同时，体外实验中使用游离脂肪酸（FFA）刺激THP-1来源的巨噬细胞，发现Ox-mtDNA的释放同样显著增加，且伴随焦亡的发生。此外，通过免疫荧光和共聚焦显微镜技术，研究人员确认了Ox-mtDNA在细胞质中的分布，并进一步发现，其释放与细胞内钙离子浓度的增加密切相关。

RNA-seq分析结果显示，Ox-mtDNA能够通过调控ITPR3的表达，进而影响钙离子的释放，最终激活NLRP3炎性小体和巨噬细胞焦亡。ITPR3是一种位于内质网（ER）上的钙离子通道蛋白，其表达上调可能导致钙离子释放增加，从而促进NLRP3炎性小体的激活。实验中通过沉默ITPR3或使用CsA阻断Ox-mtDNA的释放，发现这两种方法均能显著减少钙离子的释放，进而抑制NLRP3炎性小体的激活和巨噬细胞焦亡的发生。这些结果表明，ITPR3/Ca2?/NLRP3信号通路可能是Ox-mtDNA调控巨噬细胞焦亡的关键机制。

在体外实验中，通过siRNA沉默ITPR3，研究人员观察到巨噬细胞焦亡的显著减轻，同时细胞内脂滴的形成也有所减少。这一发现进一步支持了Ox-mtDNA通过ITPR3/Ca2?/NLRP3信号通路调控焦亡的观点。而在体内实验中，使用腺相关病毒（AAV）沉默ITPR3，同样能够有效减少Ox-mtDNA的释放，降低NLRP3和Caspase1的表达水平，并显著改善肝组织的病理特征，如减少肝细胞脂肪变性、炎症和纤维化。这些结果表明，ITPR3/Ca2?/NLRP3信号通路在Ox-mtDNA介导的巨噬细胞焦亡中具有重要作用，并且其调控机制可能成为MASH治疗的新靶点。

此外，研究还发现，Ox-mtDNA的释放与细胞内ROS水平的升高密切相关。在FFA刺激下，细胞内ROS显著增加，这可能通过激活mPTP通道，导致Ox-mtDNA的释放。使用ROS清除剂DPI处理后，mPTP通道的开放被抑制，进一步验证了ROS在Ox-mtDNA释放中的关键作用。同时，通过荧光成像和透射电镜（TEM）技术，研究人员观察到Ox-mtDNA释放后，巨噬细胞的焦亡特征显著增强，包括细胞膜破裂、线粒体肿胀和炎症因子的释放。这些分子和形态学证据表明，Ox-mtDNA在MASH的发病机制中具有重要作用。

综上所述，本研究揭示了Ox-mtDNA通过ITPR3/Ca2?/NLRP3信号通路调控巨噬细胞焦亡，进而加剧MASH的病理过程。这一发现不仅加深了我们对MASH发病机制的理解，也为开发针对Ox-mtDNA的靶向治疗策略提供了理论依据。然而，尽管本研究取得了一定进展，仍存在一些局限性，例如Ox-mtDNA与ITPR3之间的具体相互作用机制、CsA可能带来的脱靶效应、AAV递送过程中的潜在副作用等，这些都需要在未来的实验中进一步探索。同时，对于不同患者群体的MASH进展模式也需要进行更深入的研究，以提高临床转化的可能性。