综述：肺动脉高压中的蛋白质生物标志物：进展、临床意义与转化挑战

《Journal of Translational Medicine》：Protein biomarkers in pulmonary arterial hypertension: advances, clinical relevance, and translational challenges

本综述系统梳理了肺动脉高压（PAH）蛋白质生物标志物研究的最新进展。文章重点比较了Olink、SOMAscan等高通量蛋白质组学平台的技术特点，评述了BNP、NT-proBNP等经典标志物的局限性，并介绍了LTBP-2、IGFBP家族成员等新型标志物的优越预后价值。作者提出整合蛋白质组学、影像学和基因组学的综合策略，为推进PAH的精准诊断和个体化治疗提供了重要见解。

　　

蛋白质组学技术推动生物标志物发现浪潮

蛋白质组学研究能够识别整体蛋白质谱，已成为发现新型生物标志物的强大方法。过去十年间，高通量蛋白质组学技术的显著进步极大地影响了PAH生物标志物的发现，使得能够同步对生物体液中的数千种分析物进行灵敏且可重复的定性和定量测量。

传统方法，如液相色谱-质谱联用（LC-MS），长期以来在蛋白质组学中不可或缺。LC-MS通常采用自下而上的策略，即蛋白质被酶解成肽段，经过色谱分离，然后通过质谱进行分析。高效液相色谱（HPLC）通过实现蛋白质的连续分离进一步增强了该方法，当其与MS联用时，允许更高的通量。其他基于MS的技术，如二维凝胶电泳（2-DE）和同量异位标签技术（如iTRAQ），也已广泛用于蛋白质分离和定量。尽管提供了高分辨率和准确性，这些方法受到其复杂性、对大量样品制备的依赖、重现性差和成本高的阻碍。这些局限性，包括可扩展性和研究间一致性的挑战，限制了它们在大型队列研究中的广泛应用。

亲和性蛋白质分析技术的最新突破，如Olink和SOMAscan平台，通过解决传统方法的许多局限性，彻底改变了蛋白质组学研究。Olink邻位延伸分析利用双重识别系统，其中两个不同的表位导向抗体与部分互补的条形码偶联。当与靶蛋白结合时，靠近的寡核苷酸发生杂交形成双链，然后通过PCR扩增并通过qPCR或新一代测序进行分析。该方法具有高特异性和灵敏度，即使是在少量样品体积中也能检测低丰度蛋白质。此外，Olink平台与高通量工作流程的兼容性使其成为识别PAH新型生物标志物的理想选择。

另一方面，SOMAscan分析使用选择性、慢解离速率修饰的适体（SOMAmers）来结合特定蛋白质。能够对每个生物样品中的多达7000种蛋白质进行定量，SOMAscan提供了全面的蛋白质组覆盖范围。当靶向较少的分析物时，它提供了高精度和动态范围，使得能够定量其他平台可能无法测量的蛋白质。这些技术通过提供更广泛的蛋白质组覆盖、更好的重现性以及与高通量分析的兼容性，显著加速了生物标志物的发现。

循环蛋白质生物标志物：从经典到新兴

PAH由于其隐匿性发病、复杂的病理生物学以及非侵入性诊断工具的有限可用性，仍然是一个临床挑战。虽然右心导管检查仍是诊断的金标准，但循环蛋白质生物标志物已成为支持PAH早期检测、风险分层和预后评估的有价值工具。可通过血液采样获取的蛋白质生物标志物，能够反映心肌应变、血管重塑、炎症和终末器官损伤等多种病理过程。为了反映它们从临床应用至实验发现的进展，循环蛋白质生物标志物被分为经典、新兴和蛋白质组学衍生类别，为理解它们在PAH诊断和管理中的作用提供了一个系统框架。

经典生物标志物：BNP、NT-proBNP与肌钙蛋白

在蛋白质生物标志物中，BNP及其无活性片段NT-proBNP是PAH中最成熟的循环生物标志物，并且仍然是唯一被常规纳入临床指南的指标。两者都是在响应心室壁应力、容量超负荷和增加的后负荷（PAH中右心室应变标志）时由心肌细胞释放的。它们的血浆浓度与肺血流动力学、右心房压力（RAP）、右心室大小和心输出量（CO）相关，并且可靠地反映疾病严重程度和预后。

临床上，BNP和NT-proBNP在PAH的初始风险评估和纵向监测中都处于核心地位。当前的ESC/ERS指南支持其用于预后评估，并且这两种多肽已被纳入几个经过验证的风险分层模型中。一项四层级风险评估策略提出了BNP和NT-proBNP的特定临界值，以定义低、中低、中高和高风险组。在REVEAL注册研究中，BNP和NT-proBNP水平与长期生存率密切相关。此外，在启动PAH靶向治疗后NT-proBNP水平的降低与运动能力、血流动力学和生存率的改善相关，强调了其作为替代治疗反应标志物的价值。

尽管有其效用，BNP和NT-proBNP对PAH并不特异，并且可能在其他心脏或全身性疾病中升高。因此，它们的解读必须结合症状、家族史和体格检查的初步评估来综合考虑。尽管如此，由于其强大的重现性、广泛的可用性和经过验证的预后价值，BNP和NT-proBNP仍然是常规临床实践中基于生物标志物的PAH风险评估的基石。

心脏肌钙蛋白（cTnI, cTnT）是心肌中的必需蛋白质，是检测心肌损伤的高度敏感标志物。当临床怀疑PAH时，肌钙蛋白被推荐作为诊断PAH的可选检测。然而，这些标志物并非在所有PAH患者中普遍可检测到。在PAH中使用肌钙蛋白的局限性在于其缺乏特异性；升高的水平也可能出现在急性冠脉综合征、心力衰竭、心肌病、心肌炎、肾功能衰竭、快速性心律失常、肺栓塞等情况下，甚至健康个体在剧烈运动后也可能出现。

新兴生物标志物：揭示PAH的多元病理生理

新兴的生物标志物已被识别，它们反映了PAH中多样的病理生理机制，如心肌重塑、内皮功能障碍、炎症和细胞外基质（ECM）纤维化，提供了超越经典标志物所能提供的信息。

在心脏功能/损伤领域，肽类Apelin及其受体存在于心脏以及全身和肺血管系统中。它们参与血管发育、细胞凋亡调节、一氧化氮依赖性血管舒张和改善心脏收缩力。循环Apelin已成为毛细血管前PH（包括PAH和其他PH）的潜在生物标志物，具有高敏感性和特异性。在apelin片段中，Apelin-17似乎是特发性PAH（IPAH）合适的血液来源诊断标志物，与NT-proBNP相比显示出更高的AUC。骨桥蛋白是一种在心肌细胞和成纤维细胞中均有表达的糖蛋白，在心力衰竭个体中上调，因此可能代表一种有助于心力衰竭患者风险分层的新生物标志物。循环骨桥蛋白水平升高已在各种形式PAH患者中报道，包括IPAH、先天性心脏病相关PAH（CHD-PAH）和结缔组织病相关PAH（CTD-PAH）。研究证明了循环骨桥蛋白水平与平均肺动脉压（mPAP）、右心房压力（RAP）和肺血管阻力（PVR）之间的相关性。

内皮抑素是一种源自细胞外基质蛋白胶原XVIII（Col18a1）羧基末端的抗血管生成肽，在PAH中升高，并且已观察到循环内皮抑素水平与右心室结构和功能标志物之间存在强相关性。重要的是，这些发现强调了Col18a1/内皮抑素作为一个潜在的新治疗靶点，为PAH的靶向治疗策略开辟了途径。

在血管重塑/内皮功能障碍领域，内皮素-1（ET-1）通过激活ETA和ETB受体作为直接的平滑肌细胞有丝分裂原，并刺激细胞因子和生长因子的产生。PAH患者血浆ET-1水平显著升高。观察到ET-1与PVR、mPAP、CO、心脏指数（CI）和6分钟步行距离（6MWD）之间存在强相关性。然而，ET-1血浆水平不能准确反映组织浓度，并受人口统计学因素和药物的影响，可能混淆结果。

copeptin是精氨酸加压素（AVP）前体肽的C末端片段，作为AVP释放的敏感且稳定的替代标志物。发现PAH患者的循环Copeptin水平高于疾病对照组。基线Copeptin水平与纽约心脏病协会（NYHA）功能分级、6MWD、NT-proBNP、肌酐和估算的肾小球滤过率相关。升高的Copeptin水平与较短的生存期相关，并被确定为死亡率的独立预测因子。

激活素A是抑制素βA亚基的二聚体，由INHBA编码，涉及Smad2/3通路过度激活和PAH中阻塞性血管重塑的进展。激活素A的活性受内源性抑制剂调节，包括卵泡抑素和卵泡抑素样3（FSTL3）。PAH中激活素A和卵泡抑素样3的循环水平升高已被报道。研究还证明，激活素A和FSTL3的血清水平升高可预测发现队列和独立外部PAH队列中的死亡或肺移植，突出了它们作为PAH预后生物标志物的潜力。

在纤维化领域，PAH是一种以远端肺动脉和右心室ECM沉积病理变化为特征的疾病。虽然健康的ECM在维持组织结构和防止压力超负荷下的扩张方面起着至关重要的作用，但增加的纤维化会使血管壁增厚并导致管腔闭塞，引起弹性丧失和血管僵硬。此外，右心室中的ECM重塑和纤维化会导致心脏功能受损。这种病理性ECM积累和交联，使血管和右心室僵硬，是PAH的潜在治疗靶点。

几个生物标志物正在被探索用于监测PAH中的右心室功能障碍和纤维化。胶原三螺旋重复包含蛋白1（CTHRC1）是一种分泌型糖蛋白，其升高的血浆水平与右心室衰竭的临床指标相关，并且在慢性血栓栓塞性肺动脉高压（CTEPH）患者成功进行球囊肺动脉成形术（BPA）后其水平下降，表明其在监测疗效方面的作用。

另一个有前景的生物标志物是可溶性ST2（sST2），它是白细胞介素-1（IL-1）受体家族成员，已被确定为各种心血管疾病中心肌纤维化和重塑的潜在标志物。发现IPAH患者sST2水平显著升高。这些升高的血浆sST2水平与CI和PVR相关，表明可能反映了PAH疾病的严重程度。此外，升高的sST2水平与不良临床结果相关，表明其在预测PAH患者预后方面的潜在效用。

半乳糖凝集素-3已被报道介导TGF-β1诱导的心脏纤维化过程。一项评估PAH患者血浆半乳糖凝集素-3水平与已验证风险评分之间关系的初步研究发现，根据REVEAL 2.0风险评分，半乳糖凝集素-3水平随着风险层级的升高而逐渐增加。此外，根据ESC/ERS指南和右心性能的超声心动图评估定义为低风险的患者中，半乳糖凝集素-3水平显著较低，表明其在风险分层中的潜在作用。

在炎症/氧化应激领域，炎症是PAH的驱动因素，PAH患者外周血中细胞因子和趋化因子的增加与生存率和疾病严重程度相关。几种细胞因子，包括IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10和IL-12p70，以及肿瘤坏死因子-α（TNFα），在PAH中升高。此外，发现IL-6、IL-8、IL-10和IL-12p70水平可预测患者生存率。生长分化因子-15（GDF-15）是TGFβ超家族成员，在IPAH中与平均右心房压和肺毛细血管楔压升高、较低的混合静脉血氧饱和度（SvO₂）以及较高的尿酸和NT-proBNP水平相关。结缔组织生长因子（CTGF）的血浆浓度与肺动脉收缩压（RVSP）、mPAP和PVR呈正相关，与SvO₂呈负相关。CTGF在PAH中的诊断效能与BNP相当。

C反应蛋白（CRP）是炎症和组织损伤的标志物。发现PAH患者的循环CRP水平高于对照组受试者。CRP水平与NYHA功能分级、RAP和6MWD相关，并且在非幸存者中显著高于幸存者。

在终末器官功能障碍领域，肾功能不全与更差的血流动力学特征相关，并且是PAH死亡率的独立预测因子。血清肌酐（SCr）提供了肾功能的基本评估。在一项涉及500名PAH患者的队列研究中，肌酐水平升高与较高的RAP、较低的CI和增加的死亡率相关。胱抑素C（CysC）是一种新的肾功能标志物，可预测左心衰竭和心血管死亡率。发现PAH队列中的CysC异常升高。CysC与右心室舒张末期容积、右心室收缩末期容积、质量指数、应变和应变率呈正相关，与右心室射血分数（RVEF）和三尖瓣e'速度呈负相关。

蛋白质组学驱动的新型生物标志物

除了已确立的诊断和预后标志物外，高通量蛋白质组学技术为识别PAH中新型循环蛋白质生物标志物开辟了新前沿。诸如SOMAscan、Olink和数据依赖性采集质谱（DDA-MS）等平台现在能够以高灵敏度、重现性和最少的样品处理，从小体积血浆样品中对数千种蛋白质进行无偏定量。

例如，Boucherat及其同事采用了一种多组学方法，整合了右心室转录组学和蛋白质组学分析与使用Olink平台的心脏代谢血浆蛋白质分析。他们识别出在右心室失代偿的PAH患者的右心室组织和血浆中持续升高的五种蛋白质（COL18A1, LTBP-2, TNC, COL6A3, CA1）。其中，LTBP-2显示出最高的AUC，显著优于NT-proBNP。作者还证明，LTBP-2与右心室功能相关，并在两个PAH队列中为预测生存率增加了超越当前风险分层模型的增量价值。

在另一项研究中，Nies等人使用Orbitrap平台对胰蛋白酶消化的血浆样品应用DDA-MS，识别出153种在IPAH患者和健康对照组之间差异表达的血浆蛋白质。其中，碳酸酐酶2（CA2）、激肽释放酶（KLKB1）和胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP）家族成员（IGFBP1-7）通过免疫分析法得到了验证。值得注意的是，IGFBP1和IGFBP2与升高的PVR相关，而IGFBP2、IGFBP4和IGFBP7与降低的6MWD和生存率相关。在另一项独立工作中，Torres等人专门研究了不同PAH亚型中的血清IGFBP4水平。他们发现CTD-PAH和IPAH患者的IGFBP4水平显著升高，并且与疾病严重程度、临床恶化和生存率降低有强关联。

在更广泛的蛋白质组学筛选中，Rhodes等人利用SOMAscan V3分析了多个PAH队列中的1129种血浆蛋白质。他们识别出九种蛋白质（IL1R4, EPO, Factor D, IGFBP1, TIMP2, TIMP1, Factor H, Plasminogen, EPO），这些蛋白质能够独立于NT-proBNP预测生存率。后来，使用扩展的SOMAscan V4（>4000种蛋白质），他们识别出31种与预后显著相关的蛋白质，独立于6MWD、年龄、性别或NT-proBNP。由此，他们推导出一个六标志物组合（SVEP1, PXDN, renin, NRP1, TSP2, PRDX4），当与临床变量整合时改善了风险分层。

Harbaum等人也利用SOMAscan（V4）分析了特发性和遗传性PAH中的血浆蛋白质组。在4152种注释蛋白质中，208种在PAH患者和健康对照组之间差异表达。其中，49种蛋白质，包括已建立的标志物如BNP和ANG2，可预测长期生存率。与蛋白质数量性状位点（pQTL）和孟德尔随机化（MR）分析的整合识别出两种蛋白质，NET4（netrin-4，由NTN4编码）和TSP2（血小板反应蛋白-2，由THBS2），在PAH中具有因果作用。

Bouzina等人的进一步工作采用Olink分析测量了48名初治PAH患者在诊断时以及其中33名在早期随访时重新评估的血浆代谢生物标志物，同时以16名健康对照者作为对照。在分析物中，发现成纤维细胞生长因子-23（FGF-23）在PAH患者中显著升高，并且与疾病严重程度、不良血流动力学和更高的风险分层谱有强关联。重要的是，FGF-23水平在治疗后下降，并与临床参数的改善相关。这些发现强调了FGF-23作为PAH疾病监测和治疗反应评估的有前景的生物标志物，需要在更大规模的纵向队列中进行验证。

炎症蛋白质组学也产生了有希望的结果。Mickael及其同事利用Olink炎症标志物面板同时分析了临床特征明确的IPAH患者和硬皮病相关肺动脉高压（SSc-PAH）患者外周血中的92种生物标志物，识别出20种差异表达的标志物。其中，六种标志物（AXIN-1, ST1A1, CXCL1, STAMBP, SIRT2, CASP8）仅在IPAH中增加，而11种炎症标志物在SSc-PAH和IPAH患者中增强：VEGFA, CD8A, CXCL9, MMP1, IL-15RA, PD-L1, HGF, TNF, X4EBP1, CCL28, CD40。

Yokokawa等人进一步使用Olink平台关注炎症相关蛋白质，发现血浆FSTL3和SPON1水平升高在PAH诊断时独立地与死亡或肺移植相关，并且在2015年ESC/ERS风险评分、REVEAL 2.0风险评分和精炼的四层级风险评估之上增加了增量预后价值。这两种蛋白质作为PAH新生物标志物的吸引力得到了在不同评估方法的独立队列中显示类似结果的研究的支持。

一些早期阶段的蛋白质组学研究，尽管受限于小样本量和早期技术，但也为识别PAH中潜在的新型生物标志物做出了贡献。在成人IPAH患者中，Abdul-Salam等人使用SELDI-TOF MS筛选了27名患者和26名对照者血浆样品中的差异表达蛋白质，检测到234种独特的蛋白质离子。其中，补体4a（C4a des Arg）通过ELISA确认在IPAH中升高，在0.6 μg/mL的临界值下达到92%的分类准确度。然而，仍需要更广泛的验证。

类似地，Zhang等人利用2-DE和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对10名IPAH患者与10名正常受试者进行了血清蛋白质的临床筛选，识别出九种在组间显著不同的蛋白质及其异构体。富亮氨酸α-2-糖蛋白（LRG）浓度通过ELISA确认在IPAH患者中比对照组高2.7倍，并且与右心室舒张末期内径和右心房内径显著相关。

在一项针对患有先天性室间隔缺损的儿科患者的独立研究中，基于iTRAQ的蛋白质组学识别出107种在有和无PAH的患者之间差异表达的血浆蛋白质。值得注意的是，在独立队列中验证了脂联素（ADIPO）、多巴胺β-羟化酶（DBH）和丙氨酰膜氨肽酶（ANPEP）水平的升高。源自这些标志物的复合风险评分在预测PAH发病方面达到了0.87的AUC，表明在先天性心脏病儿童的早期分层中具有潜在效用。

挑战与未来方向

PAH生物标志物的发现已经取得了显著进展，但一些挑战仍然阻碍了它们向临床实践的转化。大多数新兴生物标志物仍处于实验和基础研究阶段，缺乏大规模临床验证所需的广泛验证。现有生物标志物的一个主要局限性是其特异性不足。虽然一些生物标志物在一系列疾病（如左心衰竭和肺栓塞）中表现出高预测和预后价值，但它们缺乏特异性使其不适合PAH的精确诊断。然而，这些生物标志物作为预后指标具有巨大潜力，为患者健康和疾病进展提供了宝贵的见解。为了确定它们的临床效用，必须进行具有明确患者队列的大规模验证研究。基于人群的病例对照研究对于评估这些生物标志物与既定标准相比的预后性能尤为重要。

另一个挑战在于生物标志物发现中对质谱技术的依赖。虽然有效，但使用特定技术平台或队列识别的生物标志物通常缺乏普适性。样品收集、处理和分析方案的标准化对于确保研究间的重现性和可比性至关重要。分析前和分析程序的差异可能导致不一致的结果，从而阻碍潜在生物标志物的验证和临床实施。基于抗体的Olink和基于适体的SOMAscan允许用于特定生物标志物或生物标志物组合。在一个检测组合中，不同的蛋白质分别