综述：水产养殖中益生菌的综合概述：从功效评估到多样化应用

《Annals of Microbiology》：A comprehensive overview of probiotics in aquaculture: from efficacy evaluation to diverse applications

本综述系统阐述了益生菌在水产养殖中的关键作用，重点介绍了其从菌株筛选（包括安全性、pH/胆盐耐受性、病原拮抗性等体外评估）到实际应用（如改善鱼类生长性能（SGR、FCR）、增强免疫力、提高抗病力、优化水质（如降低氨氮、BOD、COD）及促进繁殖）的全过程。文章强调了益生菌作为抗生素替代品对于实现可持续水产养殖的重要性，并指出了标准化应用方案与长期生物安全性监测等未来挑战。

　　

益生菌的来源与筛选

益生菌可从中分离，其来源极为广泛，包括水生动物、水体（淡水和海水）、地下水、沉积物、土壤、雪甚至人类体内。这意味着微生物天然存在于所有生态系统中。具有潜在应用价值的益生菌并不局限于水生来源，探索非常规来源可能会发现对水产养殖具有最大效益的新菌株。

然而，该领域的一个关键空白是缺乏从这些多样化微生物来源中分离和筛选标准化方案，这使得在不同研究结果之间进行比较变得困难。

益生菌的筛选与功效评估

评估益生菌潜在成功与否需遵循一系列指南。体外研究提供了一种经济有效的初步筛选方法。

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  安全性评估：血液溶血试验是评估益生菌菌株安全性的关键 assay。将菌株在血琼脂上培养以评估其溶解红细胞的能力。溶血可分为三种类型：α溶血（部分溶血，呈绿褐色）、β溶血（完全溶血，形成透明圈）和γ溶血（不溶血）。安全的益生菌菌株应表现为γ溶血或弱α溶血，因为β溶血通常与病原菌相关。但必须承认，一些非致病性共生菌也可能表现出一定程度的α甚至弱β溶血，这使得单独依靠此 assay 来绝对判断安全性变得复杂。
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  抗生素敏感性：微生物天然产生能抑制其他微生物生长的化合物。因此，抗生素抗性基因（ARGs）普遍存在。一些益生菌如芽孢杆菌属（Bacillus spp.）天生对某些抗生素（如青霉素、卡那霉素）具有抗性。一个持续存在的挑战是，益生菌像所有细菌一样，在引入养殖环境后可能从环境中获得抗性基因。这种获得性抗性的潜力对益生菌在水产养殖中安全可持续的使用构成了挑战，需要进行非常仔细的监测。
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  粘附定植能力：益生菌菌株粘附于肠道表面、聚集并成功在宿主体内定植的能力对其发挥益生潜力至关重要。粘附到肠道粘膜可增强其在肠道中的持久性，竞争性排除病原体，并促进与宿主的有益相互作用。自聚集和共聚集特性有助于生物膜形成和竞争性排除有害微生物。
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  胃肠道环境耐受性：筛选益生菌菌株最重要的特征之一是其对宽范围pH值和胆汁酸浓度的耐受能力，这使它们能够在胃肠道内存活并保持活性。有效的益生菌必须证明能够耐受苛刻的胃肠道条件，特别是胃中的低pH值（pH 2-3）和肠道中胆汁盐的存在（通常为0.3-0.5%）。虽然在体外使用较高浓度的胆汁盐进行筛选有指导意义，但应考虑鱼类的物种特异性生理数据。
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  病原拮抗作用：潜在益生菌候选菌株最重要的属性之一是其对病原体的拮抗作用。这种作用是指益生菌抑制或抑制鱼类致病性有害细菌生长和毒力的能力。这种拮抗作用的机制包括产生抗菌物质（如细菌素、有机酸、过氧化氢和其他次级代谢产物）、竞争肠道粘膜上的粘附位点（竞争性排除）以及竞争必需营养素。实验室和体内研究证实，在饲料或水中应用此类益生菌可以显著降低由这些病原体引起的感染发生率和严重程度。

尽管这些体外方法很有用，但它们通常无法完全模拟鱼类肠道内的复杂条件，这可能导致实验室结果与实际效果之间存在显著差异。因此，进行体内补充研究对于确认所提议菌株的适用性至关重要。

益生菌的作用机制、作用模式及在水产养殖中的应用

近年来，水产养殖研究集中在益生菌应用的重要性上，益生菌通过不同的机制，明显有益于鱼类健康，促进生长和预防疾病，同时改善肠道和血液健康。

对生长性能的影响

在鱼类养殖中，营养是促进生长和生产的关键之一。在饲料中使用益生菌对生长速率、消化和饲料利用以及成本降低具有积极影响。这种对生长速率的积极影响归因于生长促进剂和一些其他重要效应代谢物（如水解酶）的存在，这些酶帮助鱼类最大化其营养效益。

例如，具有促进鱼类生长作用的益生菌包括粪链球菌（Streptococcus faecium）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）以及酵母酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和其他芽孢杆菌属（Bacillus spp.）菌株。维生素是刺激生长的关键因素，益生菌补充剂已被证明可以增强多种维生素（如钴胺素（B₁₂）、生物素（B₇）和维生素K）的生物利用度和活性。芽孢杆菌属益生菌，如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），可改善饲料转化率（FCR）、特定生长率（SGR）和蛋白质效率（PER）。此外，它们还能最大化低蛋白日粮的效益，潜在地降低生产成本，并提高鱼类的养分利用率和消化率，从而改善生长性能。

益生菌还有助于缩短养殖周期，提高生产效率，这是满足全球日益增长的鱼类需求的关键因素。

对健康和应激抵抗力的影响

除了公认的促进消化健康作用外，益生菌在增强宿主对疾病的抵抗力以及减轻各种应激源的负面影响方面具有深远效果。

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  对抗氧化活性和肝脏健康的影响：益生菌的应用增加了总蛋白、球蛋白和白蛋白，降低了天冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）。它们还对超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）的活性产生积极影响，这些酶活性的提高有助于增强机体对氧化应激的抵抗力。益生菌通过离子螯合、减少活性氧、防止氧化剂分泌和减少抗坏血酸自氧化等机制发挥抗氧化作用。组织学分析显示，与对照组相比，益生菌处理组的肝胰腺组织结构良好，糖原储存增加，黑素细胞中心增多。虽然组织学改善是明显的，但需要更多工作将这些形态学变化与增强健康结果所依赖的具体生理和代谢途径联系起来。
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  增强免疫力与抗病力：鱼类生活在充满病原体的水环境中，当鱼类免疫力下降时，微生物乘虚而入导致疾病。益生菌提高了鱼类抵抗疾病的能力。饲喂补充益生菌日粮的鱼类在受到海豚链球菌（Streptococcus iniae）攻击时，不显示任何临床症状或死亡。一些益生菌如粪肠球菌（Enterococcus faecium）能够产生生物素和B₁₂等维生素并改善免疫力，还能增加血红蛋白（Hb）、红细胞比容（Ht）、红细胞（RBCs）和白细胞，从而改善免疫力和疾病抵抗力，并对某些病原菌如嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）有效。饲喂含有凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）的饲料可提高白细胞计数、呼吸爆发活性、吞噬活性和溶菌酶活性，从而改善生长，增强天然免疫力，并有效抵抗嗜水气单胞菌。尽管结果令人鼓舞，但不同益生菌菌株在不同鱼类物种中刺激特定免疫途径的确切机制在很大程度上仍然未知，这限制了创建靶向免疫调节益生菌的能力。

对繁殖的影响

鱼类养殖的可持续性依赖于成功且一致的繁殖过程以及繁殖质量。繁殖质量受激素的存在和有效性的影响，激素水平随鱼类成熟阶段而变化。在鱼类（如罗非鱼、斑马鱼、虹鳟鱼、鲶鱼和金鱼）中补充益生菌已被证明可以增加关键生殖激素（如睾酮、雌激素、卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）和孕酮）的产生。这是通过上调参与kisspeptin/GnRH/GTH轴（鱼类生殖调节的核心）的基因实现的，较高剂量通常产生更大效果。然而，当前研究的一个关键空白是缺乏长期研究来追踪益生菌补充对养殖鱼类后代生殖健康的影响。

在改善水质中的作用

水质是影响鱼类养殖成败的最关键因素之一。益生菌在增强鱼类健康的同时，对于保持水质也至关重要。

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  对无机氮化合物的影响：鱼类养殖中常见的问题是氨浓度，它通过鱼类排泄自然释放到水中，对水质和鱼类健康产生负面影响。报告表明，使用某些益生菌菌株，如东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）、嗜热地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）、芽孢杆菌属（Bacillus spp.）、片球菌属（Pediococcus spp.）、肠球菌属（Enterococcus spp.）、红假单胞菌属（Rhodopseudomonas spp.）、乳杆菌属（Lactobacillus spp.）和酵母属（Saccharomyces spp.）可以降低水中的氨水平。在莫桑比克罗非鱼（Oreochromis mossambicus）池塘中使用斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）作为益生菌产品混合物，会导致硝化细菌（如亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）和硝化杆菌属（Nitrobacter））的增加，从而改善水质。微生物在维持水生生态系统平衡的氮循环中很重要。益生菌通过促进进行硝化作用（将氨转化为亚硝酸盐）和反硝化作用（将硝酸盐转化为氮气）的有益细菌来改善水质。此外，益生菌有助于分解有机废物，减少池塘中的氮化合物。然而，基于水体的益生菌的功效高度依赖于环境条件，如温度、pH值和盐度，而受控研究往往未考虑这些因素，导致田间结果不一致。这凸显了在养殖条件下进行田间试验以验证益生菌效果的重要性。
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  对生化需氧量（BOD）、化学需氧量（COD）和溶解氧的影响：益生菌可以通过改善水质和分解有机废物来帮助降低鱼缸中的化学需氧量（COD）和生化需氧量（BOD）。这通过引入能够分解有机物的有益微生物来实现。它严重依赖异养细菌。益生菌引入的有益细菌能有效分解残饵和鱼类粪便积累的有机废物，减少水中有机物的积累，从而直接降低BOD和COD水平。益生菌还被证明可以通过将有机物转化为二氧化碳来减少整个生长期间有机碳和溶解碳的积累，这最终有助于改善水质。一些益生菌菌株还能促进浮游植物的生长，通过光合作用贡献自然氧气生产。通过平衡微生物种群并限制氨、亚硝酸盐和其他有毒化合物的积累，益生菌有助于稳定溶解氧水平，防止可能导致水生生物应激或死亡的突然下降。总体而言，它们的使用支持了一个更可持续的池塘生态系统，为养殖物种提供了改善的氧气可用性。一个显著的限制是缺乏量化益生菌在各种生产系统中对BOD和COD长期影响的标准方法，这使得难以建立其使用的通用方案。
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  对硫化氢水平的影响：硫化氢（H₂S）对水生动物有毒，它是由硫酸盐还原菌在厌氧条件下意外分解有机化合物形成的。它损害线粒体中的细胞色素氧化酶，抑制细胞呼吸并减少氧气摄取，可能导致快速死亡或亚致死应激。益生菌如芽孢杆菌属（Bacillus spp.）通过增强有机废物分解和抑制产生H₂S的厌氧菌活性，在降低硫化氢（H₂S）水平方面发挥重要作用。它们还加速鱼类废物和饲料残留物的分解，防止通常产生硫化氢的沉积物积累。通过维持平衡的微生物群落和促进有益细菌的生长。

结论与未来方向

将益生菌纳入水产养殖系统的饲料和水中已被证明是非常有益的。这些微生物有助于提高鱼类的生长和存活率、改善免疫力、改善水质、减少换水需求，并创造整体更健康的养殖环境。此外，益生菌支持生殖健康，增强疾病抵抗力，并最大化饲料利用效率。因此，它们的使用不仅促进了养殖鱼类的健康和生产力，而且符合可持续和生态友好型水产养殖实践的目标。

益生菌有效性的观察差异可能与鱼类物种、使用的益生菌菌株剂量以及实验或采样方案的差异有关。

为了应对关键的商业和科学挑战，水产养殖益生菌的研究必须从简单的功效研究推进到关注以下领域：

确定不同鱼类和甲壳类物种在不同环境条件（如不同盐度、温度和pH值）下的最佳益生菌剂量，以确保为养殖户提供一致、可预测的结果。

利用宏基因组学、转录组学和蛋白质组学等技术，更好地理解益生菌与宿主肠道微生物组和免疫系统相互作用的具体机制，以开发更特异、更有效的益生菌菌株。

需要对益生菌向病原体水平转移ARGs的风险进行彻底调查，未来的研究应侧重于开发确认不含可移动ARGs的益生菌菌株，并为其安全使用建立明确的监管框架。

探索和优化新配方，如合生元（synbiotics）和后生元（postbiotics），它们可能提供更高的稳定性、更长的保质期和更大的安全性。

进行更详细的成本效益分析，为养殖户实施益生菌提供强有力的经济理由，从而缩小科学研究与商业应用之间的差距，特别是对小规模养殖场而言。

最终，益生菌的真正潜力不仅将通过持续的发现来实现，还将通过开发在各种商业养殖条件下经过验证的、稳健的、可扩展的且经济可行的应用方案来实现。