单细胞转录组解析迪庆藏猪骨骼肌细胞异质性及其与体型差异的分子关联

《BMC Genomics》：Single-nucleus transcriptome profiling of skeletal muscle in Diqing Tibetan pigs with distinct body sizes

本研究针对迪庆藏猪（DQTP）群体内体型差异的细胞分子机制不明确的问题，通过单核RNA测序（snRNA-seq）技术系统分析了大型（DQTPL）与小型（DQTPS）个体骨骼肌的细胞图谱。研究发现，DQTPL个体在肌源性细胞活性、细胞间通讯（特别是FAPs与EVRCs间的COLLAGEN、LAMININ和PTPRM通路）强度上显著增强，并鉴定出TECRL、MYOZ2、MYL1等关键差异表达基因。该研究为理解地方猪种肌肉生长调控提供了宝贵的细胞水平资源，对猪的遗传改良具有指导意义。

猪肉是全球最重要的农产品之一，而猪的骨骼肌生长和瘦肉率是决定其经济价值的关键性状。不同猪种之间，甚至同一猪种的不同个体之间，在肌肉产量和品质上存在显著差异。迪庆藏猪（Diqing Tibetan pig, DQTP）是中国云南高原地区的特色地方品种，以其对高原缺氧环境的卓越适应性而闻名。与经过高强度人工选育的商业猪种相比，迪庆藏猪经历了较少的人为选择，这导致其群体内部个体体型和产肉量存在广泛的变异。然而，这种表型变异背后的细胞水平转录组差异，尤其是骨骼肌中不同细胞类型所扮演的角色，此前尚不清晰。

为了深入解析迪庆藏猪体型差异的细胞分子基础，研究人员在《BMC Genomics》上发表了一项研究。他们利用单核RNA测序（snRNA-seq）这一前沿技术，对6月龄、体型差异显著的大型（DQTPL）和小型（DQTPS）迪庆藏猪个体的背最长肌（Longissimus Dorsi, LD）进行了高分辨率细胞图谱分析。

为开展此项研究，作者主要运用了几个关键技术方法：首先，从4头半自由放养、饲喂高原大麦和草料的6月龄雄性迪庆藏猪（2大2小）的背最长肌样本中分离细胞核；其次，使用MobiDrop单细胞RNA测序平台进行snRNA-seq文库构建和高通量测序；接着，利用Seurat和Monocle等生物信息学软件包对获得的单核转录组数据进行质量控制、细胞聚类、注释、差异基因表达分析、拟时序轨迹推断；最后，借助CellChat R包进行细胞间配体-受体相互作用网络分析。

主要研究结果

骨骼肌主要细胞群体

研究共分析了34,112个高质量细胞核，鉴定出7个主要细胞群体：肌源性谱系（包括肌细胞和卫星细胞）、纤维-脂肪源性祖细胞（Fibro-adipogenic Progenitors, FAPs）、内皮及血管相关细胞（Endothelial and Vascular-Related Cells, EVRCs）、免疫细胞（包括髓系和淋巴系）以及脂肪细胞。细胞组成分析显示，除脂肪细胞在DQTPL中比例显著较低外，其他主要细胞类型在两组间分布均衡，但细胞亚型层面存在显著异质性。

肌源性谱系亚群及差异

肌细胞是骨骼肌中最主要的细胞成分。亚群分析揭示了包括卫星细胞、神经肌肉接头相关细胞（NMJ-ACs）和7个肌细胞亚群在内的多样性。拟时序分析表明，DQTPL的肌源性分化展现出比DQTPS更活跃的状态。差异表达基因（DEGs）分析发现，在慢肌纤维亚群（myocytes-sub6）中，DQTPL相较于DQTPS有大量基因表达上调，其中TECRL和MYOZ2是两个关键基因，它们已知参与肌肉修复和纤维类型调控。

FAPs亚群及差异

FAPs可进一步分为神经相关FAPs（NA-FAPs）、血管-骨相关FAPs（VOA-FAPs）、血管相关FAPs（VA-FAPs）、肌样FAPs、线粒体富集FAPs（MT-FAPs）、间质细胞和肌腱细胞。细胞组成上，NA-FAPs在DQTPL中富集，而间质细胞和MT-FAPs在DQTPS中富集。轨迹分析显示两组FAPs分化路径不同。在均匀分布的肌样FAPs中，DQTPL高表达MYL1（快肌标志）、AMPD1（与肌肉表型相关）和FILIP1L（与细胞骨架定位相关）等基因。

EVRCs亚群及差异

EVRCs包括内皮祖细胞（EPCs）、两种内皮细胞（ECs1和ECs2，其中ECs2为线粒体代谢特征）、血管平滑肌细胞（VSMCs）、肌肉相关细胞（M-ACs）和血管周成纤维细胞（PVFs）。DQTPL中EVRCs总比例高于DQTPS。轨迹分析显示DQTPL存在从EPCs向M-ACs和ECs的分化，而DQTPS则主要向ECs分化。ECs1（成熟内皮）在DQTPL中富集，而ECs2（线粒体富集内皮）在DQTPS中富集。在M-ACs中，GADL1和IARS1等基因在DQTPL中表达更高。

骨骼肌中的免疫细胞

免疫细胞约占细胞总数的5%，包括巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞、NK/T细胞等亚群。其中，肌肉相关免疫细胞（M-AICs）可能与肌肉发育相关。总体而言，免疫细胞在DQTPL和DQTPS之间的组成和基因表达差异最小，表明其相对保守。

细胞间配体-受体相互作用网络

细胞通讯分析显示，FAPs和EVRCs是主要的信号发送者和接收者。DQTPL中FAPs与EVRCs之间的相互作用强度显著高于DQTPS。通路分析表明，与细胞外基质（ECM）组织和粘附相关的COLLAGEN、LAMININ和PTPRM通路在DQTPL中富集程度更高、相互作用更强，提示DQTPL具有更活跃的ECM重塑和血管信号环境。

研究结论与意义

本研究通过构建迪庆藏猪骨骼肌的单核细胞图谱，系统地揭示了与体型差异相关的细胞组成、基因表达和细胞通讯层面的关键差异。主要结论包括：

1. 1.
   DQTPL个体表现出更活跃的肌源性细胞状态和更强的细胞间通讯，特别是FAPs与EVRCs通过COLLAGEN、LAMININ和PTPRM等通路的相互作用，这可能共同促进了更有利于肌肉生长的微环境。
2. 2.
   鉴定出多个与肌肉生长相关的关键差异表达基因，如慢肌中的TECRL和MYOZ2，以及肌样FAPs中的MYL1、AMPD1和FILIP1L，这些基因是潜在的调控肌肉生长的候选靶点。
3. 3.
   DQTPS个体中富集的线粒体代谢相关细胞亚群（如MT-FAPs和MT-ECs）可能反映了其对高原环境的一种代谢适应，而非积极的生长状态。
4. 4.
   发现了一个可能与 thermogenesis（产热）或 intramuscular fat（IMF，肌内脂肪）沉积相关的独立脂肪细胞群体，但其具体功能需进一步研究。

这项研究不仅为理解迪庆藏猪这一珍贵地方品种的肌肉生长调控机制提供了宝贵的细胞水平见解，也为未来通过遗传手段改良猪的产肉性能、平衡生长与适应性状提供了重要的理论依据和基因资源。所构建的细胞图谱可作为研究其他物种肌肉生物学和生长发育的宝贵参考。