优化非无菌药品微生物检测的中和方法：针对方法适用性挑战的策略与标准化流程研究

《BMC Microbiology》：Optimizing neutralization strategies for microbial testing of non-sterile pharmaceutical finished products with challenging method suitability

本刊推荐：为解决非无菌药品微生物限度检测中抗菌活性难以中和、可能导致假阴性结果的安全隐患，研究人员系统开展了针对133种制药成品的微生物检测方法适用性优化研究。通过多步骤中和策略（稀释、化学中和剂添加、膜过滤组合），成功使所有标准菌株回收率达到84-105%，并为40种难中和产品建立了定制化方案。该研究为制药QC实验室提供了标准化操作流程，特别强调了对伯克霍尔德菌复合体（BCC）在水性剂型中检测的标准化，对保障药品全生命周期安全性具有重要意义。

　　

在制药行业的微生物质量控制（QC）领域，非无菌药品的微生物检测一直是个充满挑战的战场。想象一下，当一种止咳糖浆或者一支药膏因为含有抗菌成分而“隐藏”了其中的微生物污染物时，会发生什么？根据美国药典（USP）的规定，如果产品的抗菌活性无法被有效中和，那么检测时被抑制的微生物就会被视为“不存在”。这种看似合理的假设，却可能成为安全隐患的温床——那些侥幸逃脱检测的微生物污染物，可能在药品储存或使用过程中大量繁殖，最终对患者健康造成威胁，甚至引发致命风险。

这正是Alexandria大学的Michael G. Shehat团队在《BMC Microbiology》上发表的最新研究要解决的核心问题。研究人员对133种制药成品进行了系统的微生物检测方法适用性研究，特别聚焦于那些中和过程尤为复杂的40种产品。他们发现，常规的1:10稀释方法往往不足以中和强效抗菌成分，而需要通过多步骤优化策略——包括梯度稀释（最高达1:200）、添加中和剂（1-5% Tween 80、0.7%卵磷脂）以及膜过滤技术组合——才能确保微生物的可靠回收。更值得关注的是，该研究还特别强调了伯克霍尔德菌复合体（Burkholderia cepacia complex, BCC）在水性剂型中的检测标准化，这一在传统QC流程中常被忽视的关键环节。

为开展这项研究，团队主要运用了三种关键技术方法：首先是微生物回收率验证实验，使用包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和伯克霍尔德菌复合体（BCC）在内的6种标准菌株，通过麦氏比浊法（McFarland标准）标准化接种物浓度；其次是中和策略系统优化流程，采用阶梯式实验设计（图示1-3），依次测试稀释法、化学中和剂添加和膜过滤技术的不同组合；第三是特异性病原体检测技术，按照USP<62>章要求，通过选择性培养基（如伯克霍尔德菌选择性琼脂BCSA）和确认试验（如氧化酶试验）进行病原体鉴定。所有实验均在Borg制药工业的QC实验室完成，样本涵盖2022年9月至2025年6月期间测试的133种制药成品。

方法适用性测试与中和策略优化

研究团队建立了一套系统的中和方案优化流程（图1）。对于需氧菌总数（TAMC）测试，初始1:10稀释若无法达到USP规定的50-200%回收率标准，则逐步引入1-4% Tween 80、0.7%卵磷脂或两者组合。固体剂型可测试高达1:100的稀释度，水性剂型则采用膜过滤技术（图2）。针对酵母菌和霉菌总数（TYMC）测试，类似流程被应用，但培养条件调整为20-25°C、5-7天。对于最难中和的产品（主要是抗菌药物），研究人员开发了“双重过滤”技术：先使用8μm预过滤器吸附抗菌成分，再通过0.45μm滤膜捕获微生物。

制药成品特性与中和挑战

在40种需要优化中和方法的成品中，22种需要多步骤处理（表2）。这些产品根据剂型和抗菌特性可分为几类：口服液体制剂（如含帕拉金类防腐剂的BOA101）、局部用制剂（如含酮康唑的洗发水BTA102）和固体剂型（如含抗生素的片剂）。研究显示，所有含抗菌药物活性成分（API）的产品（如阿奇霉素、左氧氟沙星）均需膜过滤步骤才能有效中和，而仅含常规防腐剂（如帕拉金）的产品通过稀释和中和剂添加即可解决。

中和程序对标准菌株的毒性评估

关键发现之一是所有中和方法对测试微生物均显示最小至无毒性影响（表3）。微生物回收率保持在84-105%之间，表明中和剂本身不会抑制微生物生长。特别值得注意的是，白色念珠菌（Candida albicans）和巴西曲霉（Aspergillus brasiliensis）在胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）和沙氏葡萄糖琼脂（SDA）上的回收率略有差异，但均在可接受范围内。

特定微生物检测的方法优化

针对USP要求必须缺失的特定病原体（如大肠杆菌E. coli、伯克霍尔德菌复合体BCC），研究团队优化了检测方案（图3）。11种产品使用与微生物计数相同的中和方法，8种通过1:10稀释加选择性培养基富集即可有效检测。特别重要的是，所有水性剂型均建立了BCC检测方案，使用伯克霍尔德菌选择性琼脂（BCSA）和确认试验，弥补了传统QC流程中的关键漏洞。

微生物回收率结果分析

通过优化的中和方法，所有22种难处理产品均实现了可接受的微生物回收率（图4）。含尼福拉西（nifuroxazide）的口服混悬液（BOA102）需1:100稀释加5.5% Tween 80和0.7%卵磷脂用于TAMC检测，而TYMC仅需1:10稀释手动震荡。局部抗生素乳膏（BTA107）则需要1:200稀释加五次冲洗的双重过滤。这些结果凸显了“个体化”中和方案的必要性。

本研究通过系统的方法学优化，为非无菌制药产品的微生物质量控制提供了实用解决方案。研究人员证实，即使是最难中和的抗菌产品，通过阶梯式中和策略也能实现可靠的微生物检测。这一发现挑战了当前QC实践中“难以中和即视为无菌”的假设，强调了对所有产品进行充分方法验证的必要性。

特别有意义的是对伯克霍尔德菌复合体（BCC）检测的标准化。作为水性药品的重要机会致病菌，BCC污染在发展中国家常被低估或漏检。本研究建立的方法填补了这一关键空白，为制药企业提供了可操作的检测流程。

研究局限性在于未探索Tween 80和卵磷脂之外的中和剂，未来研究可扩展至组氨酸、硫代硫酸钠等更广谱中和剂的评估。然而，当前建立的系统化流程已为QC实验室提供了实用框架，有助于防止类似1902年印度鼠疫疫苗破伤风污染致19人死亡的悲剧重演。随着抗菌耐药性威胁日益增长，对药品微生物质量的严格监控显得尤为重要——本研究为此提供了科学基础和实用工具，最终助力提升药品全生命周期安全性。