β-胡萝卜素通过靶向多重耐药白色念珠菌生物膜关键通路促进糖尿病伤口愈合的机制研究

《BMC Microbiology》：The dual antifungal and antibiofilm activities of β-carotene against multidrug-resistant Candida albicans induce wound healing in a diabetic rat model: an in vitro and in vivo study

本研究针对糖尿病伤口易感染且难以愈合的临床难题，聚焦于多重耐药(MDR)白色念珠菌(C. albicans)生物膜形成的顽固性问题。研究人员系统探讨了β-胡萝卜素对这一病原体的抗真菌和抗生物膜活性。结果表明，β-胡萝卜素(200μg/ml)不仅能有效抑制浮游菌生长，还能通过干扰粘附、抑制酵母-菌丝转换、降低固着细胞活性和减少胞外多糖(EPS)产生等多重机制，显著破坏成熟生物膜结构。尤为重要的是，该研究首次揭示了β-胡萝卜素通过下调ALS3基因表达并与凝集素样蛋白3(Als3)结合(-9.8 kcal/mol)，从而阻断生物膜形成的关键通路。体内实验进一步证实，β-胡萝卜素治疗可使糖尿病大鼠伤口愈合率达到89%，显著降低真菌负荷并改善组织病理学特征。这项研究为开发针对MDR C. albicans感染的新型治疗策略提供了重要的实验依据，具有显著的临床应用前景。

　　

在糖尿病日益成为全球健康挑战的今天，糖尿病患者面临的不仅仅是血糖控制的难题，更令人困扰的是由此引发的各种并发症。其中，糖尿病伤口的难愈性问题尤为突出，这些伤口不仅愈合缓慢，而且极易发生感染，形成慢性创面，严重时甚至导致截肢的悲剧。更糟糕的是，高血糖环境为各种微生物提供了滋生的温床，特别是白色念珠菌(Candida albicans)这类机会性病原体，它们往往趁虚而入，在伤口处定居并形成顽固的生物膜。

生物膜就像是微生物为自己建造的"堡垒"，一旦形成，就能有效抵御外界攻击，包括抗生素和治疗药物。而对于白色念珠菌来说，问题更加复杂——近年来，多重耐药(MDR)菌株的出现使得传统抗真菌药物如氟康唑(FLC)、咪康唑(MIC)等纷纷失效，临床治疗陷入了困境。面对这一挑战，研究人员将目光投向了天然产物，希望从大自然中寻找新的解决方案。

在这项发表于《BMC Microbiology》的研究中，Al-Monofy等人系统探究了β-胡萝卜素——这种常见于胡萝卜、番茄等蔬菜中的天然色素——对抗MDR白色念珠菌的潜力。研究团队不仅验证了β-胡萝卜素的直接抗真菌效果，更深入解析了其破坏生物膜形成的分子机制，并在糖尿病大鼠模型中评估了其促进伤口愈合的实际效果。

为了全面评估β-胡萝卜素的抗真菌和抗生物膜活性，研究团队采用了一系列先进的实验技术方法。他们从伤口样本中分离得到20株白色念珠菌临床菌株，并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行准确鉴定。采用肉汤微量稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)，并通过时间杀灭实验分析生长动力学。生物膜形成能力通过结晶紫(CV)染色法定量评估，而生物膜破坏效果则在聚苯乙烯板和硅导管两种模型上进行验证。通过激光共聚焦显微镜(CLSM)和分子对接技术，研究人员深入探究了β-胡萝卜素的作用机制，包括其对细胞活力、生物膜厚度以及ALS3基因表达和Als3蛋白功能的影晌。最终，在链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠伤口感染模型中验证了β-胡萝卜素的治疗效果。

β-胡萝卜素对白色念珠菌的抑制作用

研究结果显示，β-胡萝卜素(200μg/ml)对所有测试的白色念珠菌菌株均表现出显著的抗真菌活性，抑菌圈直径在14-34毫米之间。通过肉汤微量稀释法测定的MIC值在50-100μg/ml范围内。亚甲蓝染色证实了β-胡萝卜素处理后的真菌细胞失去活性，而生长动力学分析进一步支持了其浓度依赖性的抗真菌效果。

生物膜形成能力评估

通过结晶紫染色法，研究人员发现8株MDR白色念珠菌(CA 2,3,5,6,8,14,17,20)和标准菌株MTCC 227均能形成强生物膜(OD值≥4×ODC)，这些菌株被用于后续的抗生物膜实验。

β-胡萝卜素的抗生物膜活性

在聚苯乙烯板模型中，β-胡萝卜素以浓度依赖的方式显著破坏成熟生物膜，在100μg/ml和200μg/ml浓度下的生物膜清除率分别达到50-70%和80-95%。硅导管模型中的结果同样令人鼓舞，清除率达到30.6-49.8%(100μg/ml)和55-75.9%(200μg/ml)。

生物膜破坏的形态学证据

通过简单染色、双重染色和荧光染色等多种显微镜技术，研究团队直观展示了β-胡萝卜素对生物膜结构的破坏作用。处理后的生物膜显示生物量减少、菌丝结构消失，主要残留酵母细胞形态。CLSM分析进一步证实，β-胡萝卜素处理显著降低了生物膜内细胞活力(减少61-85%)和生物膜厚度(从100μm降至20-25μm)。

抗生物膜机制探究

研究深入揭示了β-胡萝卜素的多靶点作用机制：首先，它显著抑制白色念珠菌的粘附能力，在0.5 MIC浓度下粘附抑制率高达90%；其次，完全阻断了酵母-菌丝形态转换；第三，显著降低生物膜内固着细胞活力(达80%)；第四，有效抑制胞外多糖(EPS)产生，减少幅度达55.6-95.6%。

分子水平的作用机制

在基因表达层面，β-胡萝卜素(0.5 MIC)显著下调了菌丝特异性基因ALS3的表达(降低55-85%)。分子对接分析显示，β-胡萝卜素能够与Als3蛋白形成稳定的复合物，结合自由能达-9.8 kcal/mol，通过空间位阻效应干扰其生物学功能。

体内治疗效果验证

在糖尿病大鼠伤口感染模型中，β-胡萝卜素治疗组表现出显著的伤口愈合加速效果。治疗12天后，伤口愈合率达到89%，显著高于对照组(52%)。同时，治疗组伤口处的真菌负荷(平均log CFU/g=5.4)明显低于对照组(6.6)。组织病理学检查显示，治疗组伤口呈现完整的表皮再生、肉芽组织形成和少量炎症细胞浸润，而对照组则表现为广泛的皮肤溃疡和坏死组织。

本研究系统阐述了β-胡萝卜素作为天然抗真菌剂的多重优势：它不仅对浮游状态的MDR白色念珠菌具有直接杀伤作用，更能通过多靶点机制有效破坏成熟的生物膜结构。特别值得关注的是，β-胡萝卜素能够干预生物膜形成的多个关键阶段——从初始粘附、菌丝形成到基质成熟，这种多环节的干预策略大大降低了真菌产生耐药性的风险。

在分子机制层面，研究首次揭示了β-胡萝卜素通过调控ALS3基因表达和直接干扰Als3蛋白功能的双重途径，阻断了白色念珠菌的致病关键通路。这一发现不仅解释了β-胡萝卜素的抗生物膜活性，也为针对这一靶点的药物设计提供了新思路。

糖尿病伤口感染模型的成功治疗进一步验证了β-胡萝卜素的临床应用潜力。与传统抗真菌药物相比，β-胡萝卜素具有天然、低毒、多靶点等优势，特别是其对生物膜的有效破坏能力，为解决临床顽固性感染提供了新的希望。

总的来说，这项研究为开发基于天然产物的抗真菌策略提供了坚实的实验依据，不仅为解决MDR白色念珠菌感染这一临床难题提供了新方案，也为糖尿病伤口愈合的综合管理策略增添了新的可能。随着进一步的研究和开发，β-胡萝卜素有望成为抗真菌治疗武器库中的重要补充，特别是对于传统药物治疗无效的复杂感染病例。