综述：甲基丙二酸血症动物模型：进展与挑战

《Orphanet Journal of Rare Diseases》：Animal models of methylmalonic acidemia: insights and challenges

本综述系统梳理了甲基丙二酸血症（MMA）这一罕见遗传代谢病的动物模型研究进展，重点分析了MMUT和MMACHC基因工程小鼠模型及斑马鱼模型的构建策略、病理特征与应用价值。文章深入探讨了不同模型在模拟人类疾病表型、揭示发病机制（如线粒体功能障碍、氧化应激）和评估治疗手段（包括基因治疗、mRNA疗法和饮食干预）方面的独特优势与局限性，为推动MMA的精准治疗研究提供了重要参考依据。

　　

动物模型在MMA研究中的重要性

甲基丙二酸血症（MMA）是一种罕见的常染色体隐性遗传代谢病，由于甲基丙二酸代谢途径中的酶缺陷引起。该病首次于1967年被报道，其主要发病机制源于编码甲基丙二酰-CoA变位酶（MCM或MMUT）或其辅酶5'-脱氧腺苷钴胺素合成所需蛋白的基因发生突变。这些突变导致MCM活性降低，影响甲基丙二酰-CoA向琥珀酰-CoA的转化（后者是三羧酸循环的关键中间体），并破坏缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、胆固醇和奇数链脂肪酸的氧化代谢。其后果是甲基丙二酰-CoA、甲基丙二酰肉碱、甲基丙二酸、丙酸和丙酰肉碱（C3）等中间代谢物在血液中积累，引起患儿出现一系列临床症状。

MMA通常表现为全身组织损伤，尤其影响中枢神经系统。患者常经历反复性酸中毒、呼吸窘迫、生长发育迟缓和智力障碍、嗜睡，严重时可导致死亡。全球MMA患病率因地区和人群而异，但在中国发病率显著更高，例如山东和河南的新生儿筛查数据显示发病率分别高达1:3,920和1:6,032。由于疾病的复杂性和变异性，以及临床研究在伦理、样本量和侵入性机制探索方面的限制，临床前模型，尤其是动物模型，在弥补这些空白方面发挥着关键作用。

MMA的发病机制

甲基丙二酸是参与多种生化反应的关键代谢中间体。其主要代谢途径包括通过MCM转化为琥珀酰-CoA，进而参与TCA循环和能量代谢。在MMA患者中，MCM或其辅酶腺苷钴胺素（AdoCbl）的缺陷导致甲基丙二酸积累，引发代谢紊乱和多种临床症状。根据酶缺陷类型，MMA主要分为两大类：MCM缺陷（mut型）和AdoCbl代谢障碍。MCM缺陷由MMUT基因突变引起，根据MCM残余活性有无，进一步分为mut⁰和mut^-亚型。由AdoCbl代谢障碍引起的MMA则包括cblA、cblB、cblC、cblD、cblD-2、cblF、cblJ和cblX等多种亚型。其中mut⁰、mut^-、cblA、cblB和cblD-2亚型主要表现为甲基丙二酸水平升高，称为孤立性MMA；而cblC、cblD、cblF、cblJ和cblX亚型由于同时影响AdoCbl和甲基钴胺素的合成，导致甲基丙二酸血症合并高同型半胱氨酸血症。在中国，合并型MMA约占病例的70%，其中cblC型最为常见，主要由MMACHC基因突变导致。

MMA的鼠类模型

当前全球MMA研究主要集中在开发由MMUT基因突变引起的mut型MMA小鼠模型，其次是与MMACHC基因突变相关的cblC型MMA模型。

Mut型小鼠模型

Peters等人首次利用基因打靶技术破坏了MCM的CoA结合域，用抗生素选择标记替换了MMUT基因的第3外显子，从而创建了mut⁰型MMA模型，称为Mut^-/-小鼠。这些小鼠出生时表现正常但完全缺乏MCM活性，导致在24小时内迅速恶化死亡。其血液和尿液中可检测到甲基丙二酸、三羧酸和C3等代谢物水平升高，密切模拟了mut⁰型患者的严重表型。利用该模型，Chandler等人向新生Mut^-/-小鼠肝脏直接注射含有鼠源MMUT cDNA的E1/E3缺失腺病毒，治疗小鼠代谢物水平降低，存活期延长。后续研究使用重组腺相关病毒血清型8（rAAV8）载体递送MMUT cDNA，进一步证明治疗小鼠可存活至少一年，为MMA的基因治疗提供了临床前证据。

为解决Mut^-/-小鼠新生儿期或早期致死性限制长期研究的问题，Chandler等人通过将FVB/N品系基因引入（C57BL/6x129Sv/Ev）Mut^+/-品系，培育出少量混合背景（C57BL/6x129Sv/EvxFVB/N）G2代Mut^-/-小鼠，其存活超过新生儿期，血液中甲基丙二酸水平升高，使得研究人员能够在断奶前研究MMA的病理生理学和治疗干预。

Peters等人还创建了携带不同拷贝数人源MCM基因座的转基因小鼠品系，并将双拷贝品系与杂合敲除MMUT小鼠杂交，产生了部分挽救新生儿致死性的半合子小鼠（Mut^-/-; MUT2h）。这些"人源化"小鼠为研究长期高甲基丙二酸水平的影响和评估潜在治疗策略提供了宝贵工具。此外，研究人员还开发了在肝脏特异性或肌肉特异性启动子控制下表达MMUT的组织特异性小鼠模型，有助于研究MMA病理生理和治疗结果的组织特异性贡献。

MMUT敲入小鼠模型

为模拟患者中发现的特定MMUT突变，研究人员创建了敲入小鼠。例如，Forny等人将人源MMUT c.2009T>A（p.M700K）突变引入胚胎干细胞，生成敲入（ki）小鼠品系（Mut^ki/ki）。为评估基因剂量对表型的影响并创建更严重的疾病模型，将ki突变与敲除（ko）等位基因结合。Mut^ki/ki和Mut^ko/ki小鼠均表现出存活期延长但生长缓慢，其中Mut^ko/ki小鼠MCM活性更低，甲基丙二酸水平更高。高蛋白饮食挑战下，两种模型均出现血氨升高和体重减轻；但只有Mut^ki/ki小鼠在代谢危象期间对钴胺素治疗有反应，显示了基因剂量依赖性。这些模型小鼠因其长期存活，适用于研究mut型MMA的慢性临床表现和病理生理机制。

另一个敲入模型Mut^-/-;Tg^{INS-CBA-G715V}复制了MMA患者中常见的G717V突变。这些小鼠所有组织中的MCM活性均降低，血浆甲基丙二酸水平中度升高，模拟了携带G717V突变MMA患者的表型。重要的是，这些小鼠寿命正常且能耐受高蛋白饮食挑战，适用于药物干预研究。

最近，Schneller等人使用CRISPR-Cas9基因组编辑技术将mut⁰（MMUT p.R108C）或mut^-（MMUT p.G717V）错义突变引入小鼠。纯合子（Mmut^{p.R106C/p.R106C}）小鼠存活率在第57天时低于10%，多数死亡发生在头两周。然而，出生后使用表达人源密码子优化MMUT的AAV9血清型载体治疗可挽救大多数患病小鼠，使其正常存活。而Mmut^{p.G715V/p.G715V}小鼠在第111天时未表现出显著死亡率，与Mut^-/-;Tg^{INS-CBA-G715V}小鼠结果一致。

cblC型小鼠模型

为探索MMACHC在小鼠胚胎发育中的作用，Moreno-Garcia等人开发了在MMACHC基因内含子1插入基因陷阱的cblC小鼠模型（Mmachc^{Gt(AZ0348)Wtsi}）。他们证明了MMACHC蛋白水平显著降低以及血浆同型半胱氨酸和甲基丙二酸浓度升高。值得注意的是，在胚胎期（E）3.5天之后未发现Mmachc^Gt/Gt胚胎，表明MMACHC在早期胚胎发育中起重要作用。

Chern等人描述了三种不同的MMACHC相关小鼠模型。第一个是MMACHC靶向等位基因（Mmachc^tm1.1），用lacZ盒替换了第3和第4外显子。这种改变产生了一种仅包含全长279个氨基酸中前92个氨基酸的截短蛋白。与Mmachc^Gt/Gt小鼠的植入前致死性不同，Mmachc^tm1.1/tm1.1小鼠可存活至约E9.5-E15.5，并表现出类似于cblC型MMA患者的异常表型。鉴于Mmachc^Gt/Gt和Mmachc^tm1.1/tm1.1小鼠的表型严重性和胚胎致死性，Chern等人进一步生成了条件性基因敲除小鼠（Mmachc^flox/flox），以实现MMACHC的时间和组织特异性删除。例如，转基因小鼠（Mmachc^flox/flox;Pax6-Cre）特异性缺失外周视网膜细胞中的MMACHC表达。当与E2A-Cre^+/tg种系删除小鼠杂交时，后代（E2A-Cre^+/tg;Mmachc^+/flox）可存活，但E2A-Cre^+/tg;Mmachc^flox/flox胚胎无法存活超过E15.5天，与Mmachc^Gt/Gt和Mmachc^tm1.1/tm1.1小鼠的发现一致。

为研究MMACHC在功能获得条件下的作用，Chern等人开发了广泛过表达MMACHC基因的转基因小鼠模型（Mmachc-OE^+/tg）。初步结果表明，过表达减轻了Mmachc^tm1.1/tm1.1小鼠中观察到的表型，且未引起有害效应，提示增强MMACHC表达可能具有治疗潜力。

近年来，研究人员还利用CRISPR/Cas9技术将人类常见突变引入小鼠。例如，c.609G>A突变是中国最常见的MMACHC无义突变，导致提前终止密码子（p.W203X）。携带该突变的纯合子小鼠在出生24小时内表现出显著升高的C3水平，并在72小时内死亡，密切模拟了携带此突变儿科患者的严重临床表现（这些患儿很少存活超过第一周）。另一个具有临床意义的突变c.80A>G（p.Q27R）是与晚发型cblC型MMA相关的常见错义突变，常与肾脏疾病、先天性心脏缺陷、高血压、肺动脉高压和弥漫性肺病等多种继发疾病相关。2023年，Wang等人利用CRISPR/Cas9技术成功构建了携带MMACHC c.80A>G（p.Q27R）突变的cblC型小鼠模型。这些小鼠存活时间长，使研究人员能够模拟血液代谢变化并研究cblC型MMA特有的生化和病理改变。到12周时，纯合突变小鼠表现出轻微的神经系统症状，如胶质细胞增生、神经元空泡化和皮质血管充血，但这些发现与认知功能的关联尚不清楚。

除了直接靶向MMACHC基因，研究人员还探索了诱导cblC样表型的间接机制。例如，干扰MMACHC的上游转录调控因子（如宿主细胞因子C1（HCF1）和THAP结构域包含11（THAP11））会降低发育过程中MMACHC mRNA的表达，导致类似于cblC型MMA的表型。

斑马鱼MMA模型

近几十年来，斑马鱼已成为研究罕见遗传代谢病和开发新治疗策略的重要模型。与其他动物模型和体外细胞培养相比，斑马鱼具有几个显著优势：斑马鱼与人类基因和蛋白质的进化保守性非常高，便于研究人类疾病相关基因；斑马鱼胚胎发育迅速，允许在受精后24小时（HPF）内进行初步代谢筛选；其早期发育的透明性便于实时观察器官发生和细胞过程；此外，斑马鱼通过吗啉代寡核苷酸敲低、TALEN、CRISPR/Cas9和转基因修饰等技术高度易于基因操作，使其成为探索疾病发育方面和进行高通量药物筛选的特别强大模型。

为克服MMUT敲除小鼠模型致死性的限制，利用CRISPR/Cas9技术培育了MMUT缺陷斑马鱼。这些斑马鱼表现出关键的MMA表型，包括肝脏和肾脏线粒体病、行为异常、过高死亡率和增加的线粒体氧化应激。低蛋白饮食（目前MMA患者的标准治疗干预之一）部分缓解了高幼虫死亡率。该斑马鱼模型还有助于识别通过基于药物-疾病网络的计算模型预测的潜在治疗靶点。例如，线粒体抗氧化剂Mito-Q已被研究用于溶酶体贮积症的临床前模型，因其能够恢复线粒体和溶酶体功能，并被证明可减轻MMUT缺陷斑马鱼的氧化应激和疾病严重程度。此外，该模型通过揭示突变MMUT破坏了PINK1介导的PRKN/Parkin向受损线粒体的转运，损害了其通过巨自噬/自噬-溶酶体降解途径的清除，从而提供了对MMUT缺陷诱导MMA的机制见解。

最近，Sloan等人开发了cblC斑马鱼种系突变体（hg13等位基因）。该突变体表现出MMA的标志性症状，包括甲基丙二酸水平升高、视网膜病变和幼体死亡率。几种小分子，包括羟钴胺素和甲钴胺素，在该模型中有效改善了MMA相关表型，强调了其用于评估潜在治疗策略的实用性。除了代谢异常，hg13等位基因还表现出颅面缺陷，如米克尔软骨延长、腭方骨结构间距增加、非典型软骨细胞排列和舌颌骨软骨中过多的细胞连接。用编码野生型人MMACHC蛋白或位于MMACHC钴胺素结合域内的患者来源p.Gly147Asp变体的mRNA治疗斑马鱼，可逆转这些软骨细胞发育缺陷。有趣的是，这些发现表明钴胺素结合域外的区域对正常颅面发育也至关重要。

结论与展望

MMA是一种由多种基因突变引起的罕见遗传代谢病，具有复杂的病因学和模糊的临床症状。对MMA发病机制和神经损伤进展的研究一直受到疾病罕见性和获取患者组织样本的伦理限制的阻碍。开发合适的MMA动物模型在应对这些挑战方面起着关键作用，因为这些模型可以模拟患者症状，并能够研究疾病的自然史，包括行为特征、代谢副产物和组织病理学。这些模型提供了将特定突变位点与表型相关联、分析不同基因突变的发病机制、增进对MMA的理解以及促进新治疗方法开发的机会。

然而，大多数目前可用的MMA动物模型会导致胚胎致死性，显著限制了研究窗口和可观察表型。因此，迫切需要创建存活时间更长的MMA动物模型，以便对疾病机制进行更全面的研究。针对晚发型MMA患者中发现的高频突变，并利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术培育携带这些突变的小鼠，可以提高开发具有更长存活时间模型的可能性，从而更好地模拟疾病发作和进展。此外，尽管钴胺素广泛用于MMA的临床管理，但其反应性和治疗效果在动物模型中尚未得到充分表征。这强调未来研究需要在相关的钴胺素治疗MMA动物模型中建立剂量反应关系并确定治疗窗口。

当前MMA动物模型的另一个局限性是它们依赖于系统性基因干扰，这使得难以确定特定的临床症状是由系统性效应还是由基因突变引起的器官或组织局部变化所致。为解决这个问题，研究人员可以将条件性基因敲除小鼠与携带组织或细胞特异性启动子的CRE或CRE-ER小鼠杂交，或者 alternatively，使用编码CRE酶的病毒载体进行局部注射。这些方法能够精确地空间和时间操控MMA致病基因，使实验模型与特定研究目标保持一致。

大型动物模型，包括猪和非人灵长类动物，更接近人类生理学，特别是在器官大小、代谢过程和疾病进展方面。CRISPR-Cas9基因组编辑技术的最新进展使得能够培育出表现出MMA样表型的猪模型。这些模型对于评估器官特异性疗法（如肝移植和肾移植）的安全性和有效性特别有价值，由于解剖和生理差异，这些疗法在小型动物模型中难以研究。

类器官芯片技术和诱导多能干细胞（iPSC）来源的类器官的进展可作为动物模型的有价值补充，为药物发现和机制研究提供创新平台。此外，将组学技术（如基因组学、转录组学和代谢组学）与动物研究相结合，可能为疾病机制提供更深入的见解，并识别新的治疗靶点。

总之，动物模型在增进我们对MMA及其治疗的理解方面发挥了重要作用。尽管存在局限性，它们为转化研究和治疗创新提供了关键基础。通过改进现有模型并采用新技术，未来的研究可以弥合临床前研究和临床应用之间的差距，最终改善MMA患者的预后。