《BMC Cancer》：Characteristics of extracellular vesicle-derived lncRNAs during the progression of HBV-related hepatocellular carcinoma
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为破解HBV-HCC早诊缺乏无创标志物的瓶颈，Ma等追踪从CHB→LC→HA→HCC全病程，首次锁定血清EVs中10个渐进高表达lncRNA并构建lncRNA-miRNA-mRNA网络，验证其跨基质稳定性，为液体活检提供可转化新靶点。
肝癌每年导致全球约76万人死亡，其中75–85%为肝细胞癌（HCC）。慢性乙型肝炎（CHB）感染者癌变风险是非感染者的15–20倍，可经肝硬化（LC）或直接恶变。临床80%患者确诊时已失去手术机会，而金标准穿刺活检存在出血风险，影像灵敏度有限，甲胎蛋白（AFP）早期阳性率不足。因此，寻找能覆盖“肝炎—肝癌”全病程、可重复采样的无创标志物成为迫切需求。
胞外囊泡（EVs）携带来源细胞特异的RNA，是液体活检新星；其中长链非编码RNA（lncRNA）长度>200 nt，可调控增殖、血管生成与自噬，但其在HBV-HCC演进中的动态变化与调控网络尚不清楚。发表于《BMC Cancer》的这项研究，系统描绘了血清EV-lncRNA从CHB→LC→HA→HCC的时空表达谱，并验证其跨基质稳定性，为早诊提供新理论。
关键技术方法
样本队列：2024年1–3月于南开大学附属第三中心医院招募34例参与者，包括5健康对照（CON）、5 CHB、5 LC、4肝腺瘤（HA）、10 HCC用于发现队列；另取5 CON+5 HCC血浆作外部队列。
超速离心+尺寸排阻色谱分离血清/血浆EVs，纳米流式、电镜、Western blot鉴定。
转录组测序：SMARTer链特异性长RNA文库与UMI小RNA文库，Illumina HiSeq双端测序。
生物信息：edgeR差异表达、Mfuzz时间序列、Venny筛选HCC特异lncRNA；LncBase/miRDB/miRWalk构建ceRNA网络；KOBAS富集、STRING PPI与CytoHubba筛hub基因；独立t检验或Mann-Whitney U验证。
研究结果
1. EVs鉴定
纳米流式示血清EVs平均粒径77.32 nm，浓度9.53×10 particles/mL；电镜见典型杯口状双层膜；Western blot阳性表达TSG101、Alix、CD9，阴性Calnexin，证实EVs成功分离。
2. 差异表达分析
与健康对照相比，CHB、LC、HA、HCC组分别检出63、15、104、133个差异lncRNA（|logFC|>1，p<0.05），火山图与热图显示各组表达特征明显异质。
3. HCC特异lncRNA筛选
Venn分析剔除与CHB/LC/HA共享分子，获得72个HCC独有lncRNA；再与Mfuzz时间序列聚类交叉，锁定在HA或LC阶段即开始升高并持续至HCC的37个转录本，最终保留GeneCards可注释的10个核心lncRNA：ETS2-AS1、DIP2C-AS1、LINC01013、LINC01934、DAAM2-AS1等。
4. lncRNA-miRNA-mRNA网络构建
对HCC与CON血清EVs并行miRNA、mRNA测序，共得21上调+39下调miRNA、365上调+217下调mRNA。整合预测数据库，构建含62节点（6 lncRNA、11 miRNA、45 mRNA）和68条边的ceRNA网络。
5. 功能富集与hub基因
GO注释显示靶基因富集于“细胞群体增殖正调控”“钾离子跨膜转运”“胞浆/质膜定位”等；KEGG指向自噬、Ras、MAPK信号及脂肪酸合成。PPI网络筛得10个hub基因：NTRK2、KCNJ10、KCNAB2、SLC12A4、KLF6、CELF2、KCNJ6、PAX5、CFLAR、SLC35F3。
6. 外部队列验证
在血浆EVs中，ETS2-AS1、DIP2C-AS1、LINC01013及7个hub基因均显著上调，与血清趋势一致（p<0.05），ICC显示技术重现性良好，提示标志物不受采血管类型影响。
结论与讨论
该研究首次绘制HBV-HCC全病程血清EV-lncRNA动态图谱，发现10个随疾病阶梯式升高的核心lncRNA，并证实其通过ceRNA机制调控MAPK等促癌通路。外部验证显示，这些分子在血浆与血清EVs中均稳定差异表达，为开发高可重复性的无创早诊试剂盒奠定理论与实验基础。尽管样本量小、功能机制尚需体内外实验进一步验证，但其提出的“时间序列+多组学网络+独立验证”策略，为肝癌及其他恶性肿瘤的液体活检研究提供了范式。
