高效使用的尼罗红染色方法，通过流式细胞术快速定量微塑料的浓度

《Analytical Methods》：Highly efficient Nile red staining for the rapid quantification of microplastic number concentrations using flow cytometry

基于肿胀介导的尼罗红（NR）染色方法优化，本研究实现了流式细胞术（FCM）对2-10微米聚苯乙烯（PS）微塑料（MPs）的高灵敏度定量检测。通过调整THF浓度（25%）、NR浓度（10 μg/mL）和表面活性剂比例（0.1% Tween-20），染色效率达99.6±0.5%，显著高于传统表面吸附法。FCM计数效率随粒径增大而降低（10 μm时降至80.1±12.7%），但经校正后回收率仍保持≥85%置信区间。该方法成功解决了传统染色法灵敏度不足和回收率不稳定的问题，为环境MPs快速高通量检测提供了新方案。

　　本研究聚焦于微塑料（MPs）的荧光标记技术，特别是利用聚合物的膨胀现象来提高标记效率，从而实现对MPs数量浓度的准确测量。随着人们对微塑料在环境中的广泛分布及其对生态和健康潜在影响的关注不断加深，对MPs的检测与量化已成为环境科学领域的重要课题。然而，传统的荧光标记方法在检测微塑料时存在一定的局限性，例如标记效率受聚合物类型和表面特性的影响，导致部分微塑料难以被有效检测。为此，研究团队提出了一种改进的标记方法，即通过聚合物膨胀机制，使荧光染料能够深入微塑料内部，从而显著提高检测灵敏度，并实现对微米级微塑料的精准识别。

传统的荧光标记方法主要依赖于染料在微塑料表面的吸附作用。然而，这种方法在某些情况下可能无法提供足够的荧光信号强度，从而限制了其在低浓度或小尺寸微塑料检测中的应用。为了克服这一问题，研究团队引入了一种基于膨胀的标记技术，通过在微塑料中加入有机溶剂，使微塑料发生膨胀，从而促进染料分子渗透到微塑料内部。在标记完成后，通过去除有机溶剂，微塑料会收缩回其原始尺寸，将染料完全包裹在内部，从而提高了荧光信号的强度和稳定性。这种标记方法不仅提高了微塑料的荧光信号强度，还有效减少了染料的泄漏，使得检测过程更加高效和可靠。

为了验证该方法的可行性，研究团队使用了已知数量浓度的聚苯乙烯（PS）微塑料悬浮液进行实验，并通过流式细胞术（FCM）进行测量。PS悬浮液经过预处理后，通过调整THF（四氢呋喃）、Nile红（NR）和Tween-20（一种表面活性剂）的浓度，优化了整个标记流程。实验结果显示，当THF浓度在15%至30%之间时，标记效率和计数效率均接近100%。而当THF浓度低于15%时，标记效率显著下降，可能是因为微塑料未能充分膨胀，导致染料无法有效渗透。同样，当THF浓度超过30%时，微塑料的膨胀可能导致不可逆的变化，如部分溶解或颗粒融合，影响其在标记后的恢复过程。因此，选择25%的THF浓度能够实现最佳的标记效果。

在优化NR的浓度时，研究团队发现当NR浓度在1至50 μg mL?1之间时，标记效率和计数效率均保持在接近100%的水平。然而，当NR浓度超过100 μg mL?1时，标记效率和计数效率出现了相反的变化趋势。这一现象可能是由于高浓度的NR在水中形成了非荧光的聚集体，从而干扰了测量结果。通过控制NR的浓度在10 μg mL?1，研究团队能够在保证荧光强度的同时，避免染料的过度聚集。此外，Tween-20的使用进一步提升了悬浮液的稳定性，防止NR在水中形成聚集体。研究发现，当Tween-20的浓度在0.05%至1%之间时，标记和计数效率均保持较高水平，而低于0.01%的浓度则可能导致NR的聚集，从而影响测量的准确性。因此，选择0.1%的Tween-20浓度能够在不影响标记效果的前提下，提高悬浮液的稳定性。

在实际应用中，研究团队将该标记方法与FCM结合，用于对不同尺寸的微塑料进行检测。通过比较膨胀标记和非膨胀标记的微塑料样品，研究发现膨胀标记的微塑料在荧光显微镜下表现出显著更高的荧光强度，证明该方法在提高检测灵敏度方面具有优势。此外，实验还验证了该方法在不同浓度下的适用性。对于低浓度的微塑料悬浮液，FCM的计数效率较低，导致测量结果的统计可靠性下降。因此，在实际检测中，对于低浓度的样品，可能需要通过预浓缩或增加样品体积来提高测量精度。而对于高浓度的样品，由于重叠事件（coincidence loss）的存在，可能会导致计数误差。因此，对样品进行适当稀释，使其处于最佳浓度范围，是提高测量精度的重要步骤。

在对不同尺寸微塑料的检测中，研究团队发现标记效率与微塑料的尺寸关系不大，但回收率却表现出明显的尺寸依赖性。对于10 μm的微塑料悬浮液，其回收率仅为0.846 ± 0.100，远低于2 μm和5 μm的微塑料。这一差异可能源于FCM在检测大尺寸微塑料时的计数效率下降，例如由于重力沉降或微塑料在流动路径中的吸附现象。研究团队通过调整FCM的流速，并对仪器进行彻底清洁，试图减少这些因素对测量结果的影响。然而，即使经过优化，10 μm微塑料的回收率仍低于1，表明该方法在大尺寸微塑料的检测中仍存在一定的挑战。

为了进一步验证该方法的实用性，研究团队使用模拟环境样品（含自来水和高岭土颗粒）进行了回收测试。结果显示，2 μm和5 μm微塑料的回收率分别为0.993 ± 0.038和0.988 ± 0.029，接近100%的回收率，表明该方法在实际环境中具有较高的适用性。而对于10 μm微塑料，其回收率较低，但经过计数效率的校正后，仍达到0.846 ± 0.100，显示出该方法在实际应用中的可靠性。这些结果表明，尽管大尺寸微塑料的回收率较低，但通过优化标记和计数流程，仍可实现对MPs数量浓度的准确测量。

此外，研究团队还探讨了该方法在不同环境样品中的适用性。由于微塑料在自然环境中通常与其他非微塑料物质混合，因此在实际检测中，样品的预处理（如去除杂质、密度分离等）是必要的。而该标记方法能够有效适应这些预处理后的样品，只要确保染料充分渗透并保持稳定。因此，该方法不仅适用于实验室环境中的标准悬浮液，也适用于实际环境样品的检测。

总体而言，本研究提出了一种基于聚合物膨胀的微塑料荧光标记方法，并通过实验验证了其在提高检测灵敏度和准确性方面的优势。该方法在小尺寸微塑料的检测中表现尤为突出，能够有效区分微塑料与其他杂质颗粒，为微塑料的快速、高通量检测提供了新的思路。未来，研究团队希望进一步探索该方法在其他聚合物类型和复杂环境样品中的应用，以拓展其适用范围。同时，针对FCM在大尺寸微塑料检测中的效率问题，也需进行更深入的研究，以优化整个检测流程，提高微塑料数量浓度的测量精度。